Efektyviaikontroliuoti uodusir sumažinti jų platinamų ligų paplitimą, reikalingos strateginės, tvarios ir aplinkai nekenksmingos cheminių pesticidų alternatyvos. Įvertinome tam tikrų Brassicaceae (Brassica šeimos) sėklų miltus kaip augalinės kilmės izotiocianatų, gautų fermentinės hidrolizės būdu iš biologiškai neaktyvių gliukozinolatų, šaltinį, skirtą naudoti Egipto Aedes (L., 1762) kontrolei. Penkių riebalų neturintys sėklų miltai (Brassica juncea (L) Czern., 1859, Lepidium sativum L., 1753, Sinapis alba L., 1753, Thlaspi arvense L., 1753 ir Thlaspi arvense – trys pagrindiniai terminio inaktyvavimo ir fermentinio skaidymo tipai) Cheminiai produktai. Alilo izotiocianato, benzilo izotiocianato ir 4-hidroksibenzilizotiocianato toksiškumui (LC50) Aedes aegypti lervoms nustatyti esant 24 valandų poveikiui = 0,04 g/120 ml dH2O). Garstyčių, baltųjų garstyčių ir asiūklių sėklų miltų LC50 vertės buvo atitinkamai 0,05, 0,08 ir 0,05, palyginti su alilo izotiocianatu (LC50 = 19,35 ppm) ir 4-hidroksibenzilizotiocianatu (LC50 = 55,41 ppm), kuris lervoms buvo toksiškesnis praėjus 24 valandoms po apdorojimo nei 0,1 g/120 ml dH2O. Šie rezultatai atitinka liucernos sėklų miltų gamybos rezultatus. Didesnis benzilo esterių efektyvumas atitinka apskaičiuotas LC50 vertes. Sėklų miltų naudojimas gali būti veiksmingas uodų kontrolės metodas. Kryžmažiedžių sėklų miltelių ir jų pagrindinių cheminių komponentų veiksmingumas prieš uodų lervas ir parodo, kaip natūralūs kryžmažiedžių sėklų milteliuose esantys junginiai gali būti perspektyvus aplinkai nekenksmingas larvicidas uodų kontrolei.
Aedes uodų sukeliamos vektorių platinamos ligos išlieka didele pasauline visuomenės sveikatos problema. Uodų platinamų ligų paplitimas plinta geografiškai1,2,3 ir vėl atsiranda, sukeldamas sunkių ligų protrūkius4,5,6,7. Ligų plitimas tarp žmonių ir gyvūnų (pvz., čikungunijos, dengės karštligės, Rifto slėnio karštligės, geltonosios karštligės ir Zikos viruso) yra beprecedentis. Vien dengės karštligė tropikuose kelia maždaug 3,6 milijardo žmonių užsikrėtimo riziką, o kasmet užfiksuojama apie 390 milijonų užsikrėtimų, dėl kurių kasmet miršta 6 100–24 300 žmonių8. Zikos viruso pakartotinis pasirodymas ir protrūkis Pietų Amerikoje patraukė viso pasaulio dėmesį dėl smegenų pažeidimų, kuriuos jis sukelia užsikrėtusių moterų vaikams2. Kremer ir kt.3 prognozuoja, kad Aedes uodų geografinis paplitimo arealas toliau plis ir kad iki 2050 m. pusei pasaulio gyventojų grės užsikrėsti uodų platinamais arbovirusais.
Išskyrus neseniai sukurtas vakcinas nuo dengės karštligės ir geltonosios karštligės, vakcinos nuo daugumos uodų platinamų ligų dar nėra sukurtos9,10,11. Vakcinos vis dar prieinamos ribotais kiekiais ir naudojamos tik klinikiniuose tyrimuose. Uodų pernešėjų kontrolė naudojant sintetinius insekticidus buvo pagrindinė uodų platinamų ligų plitimo kontrolės strategija12,13. Nors sintetiniai pesticidai veiksmingai naikina uodus, nuolatinis sintetinių pesticidų naudojimas neigiamai veikia netikslinius organizmus ir teršia aplinką14,15,16. Dar labiau nerimą kelia didėjantis uodų atsparumas cheminiams insekticidams17,18,19. Šios su pesticidais susijusios problemos paspartino veiksmingų ir aplinkai nekenksmingų alternatyvų ligų pernešėjams kontroliuoti paiešką.
Įvairūs augalai buvo sukurti kaip fitopesticidų šaltiniai kenkėjų kontrolei20,21. Augalinės medžiagos paprastai yra nekenksmingos aplinkai, nes jos yra biologiškai skaidžios ir mažai arba nežymiai toksiškos netiksliniams organizmams, tokiems kaip žinduoliai, žuvys ir varliagyviai20,22. Yra žinoma, kad vaistažolių preparatai gamina įvairius bioaktyvius junginius, turinčius skirtingus veikimo mechanizmus, skirtus veiksmingai kontroliuoti skirtingus uodų gyvenimo etapus23,24,25,26. Augalinės kilmės junginiai, tokie kaip eteriniai aliejai ir kiti aktyvūs augalų ingredientai, sulaukė dėmesio ir atvėrė kelią novatoriškoms uodų pernešėjų kontrolės priemonėms. Eteriniai aliejai, monoterpenai ir seskviterpenai veikia kaip repelentai, atbaidantys nuo maitinimosi ir ovicidai27,28,29,30,31,32,33. Daugelis augalinių aliejų sukelia uodų lervų, lėliukių ir suaugusių individų žūtį34,35,36, paveikdami nervų, kvėpavimo, endokrininę ir kitas svarbias vabzdžių sistemas37.
Naujausi tyrimai suteikė įžvalgų apie galimą garstyčių augalų ir jų sėklų, kaip bioaktyviųjų junginių šaltinio, naudojimą. Garstyčių sėklų miltai buvo išbandyti kaip biofumigantas38,39,40,41 ir naudojami kaip dirvožemio gerinimo priemonė piktžolėms slopinti42,43,44 ir dirvožemyje plintančių augalų patogenų45,46,47,48,49,50, augalų mitybai, nematodams41,51, 52, 53, 54 ir kenkėjams55, 56, 57, 58, 59, 60 kontroliuoti. Šių sėklų miltelių fungicidinis aktyvumas priskiriamas augalų apsaugos junginiams, vadinamiems izotiocianatais38,42,60. Augaluose šie apsauginiai junginiai yra kaupiami augalų ląstelėse nebioaktyvių gliukozinolatų pavidalu. Tačiau, kai augalus pažeidžia vabzdžių mityba arba patogenų infekcija, mirozinazė hidrolizuoja gliukozinolatus į bioaktyvius izotiocianatus55,61. Izotiocianatai yra lakieji junginiai, pasižymintys plačiu antimikrobiniu ir insekticidiniu poveikiu, o jų struktūra, biologinis aktyvumas ir sudėtis labai skiriasi tarp Brassicaceae rūšių42,59,62,63.
Nors žinoma, kad iš garstyčių sėklų miltų gauti izotiocianatai pasižymi insekticidiniu aktyvumu, trūksta duomenų apie biologinį aktyvumą prieš mediciniškai svarbius nariuotakojų vektorius. Mūsų tyrime buvo nagrinėjamas keturių nuriebalintų sėklų miltelių larvicidinis aktyvumas prieš Aedes uodus. Aedes aegypti lervos. Tyrimo tikslas buvo įvertinti jų galimą naudojimą kaip aplinkai nekenksmingus biopesticidus uodų kontrolei. Taip pat buvo išbandyti trys pagrindiniai sėklų miltų cheminiai komponentai: alilo izotiocianatas (AITC), benzilo izotiocianatas (BITC) ir 4-hidroksibenzilizotiocianatas (4-HBITC), siekiant nustatyti šių cheminių komponentų biologinį aktyvumą uodų lervoms. Tai pirmoji ataskaita, kurioje įvertintas keturių kopūstų sėklų miltelių ir jų pagrindinių cheminių komponentų veiksmingumas prieš uodų lervas.
Laboratorinės Aedes aegypti (Rockefeller padermė) kolonijos buvo laikomos 26 °C temperatūroje, 70 % santykinėje drėgmėje (RH) ir 10:14 val. (L:D fotoperiodas). Suporuotos patelės buvo laikomos plastikiniuose narveliuose (11 cm aukščio ir 9,5 cm skersmens) ir maitinamos iš buteliuko citratuotu galvijų krauju („HemoStat Laboratories Inc.“, Diksonas, Kalifornija, JAV). Kraujas buvo duodamas kaip įprasta, naudojant membraninį daugiastiklinį tiektuvą („Chemglass“, „Life Sciences LLC“, Vinelandas, Naujasis Džersis, JAV), prijungtą prie cirkuliuojančio vandens vonios vamzdelio („HAAKE S7“, „Thermo-Scientific“, Walthamas, Masačusetsas, JAV), kurio temperatūra buvo kontroliuojama 37 °C. Ant kiekvienos stiklinės maitinimo kameros dugno (154 mm2 plotas) užtepkite „Parafilm M“ plėvelę. Tada kiekviena tiektuvė buvo uždėta ant viršutinių grotelių, dengiančių narvelį, kuriame buvo poruojanti patelė. Į stiklinį tiekimo piltuvėlį, naudojant Pastero pipetę („Fisherbrand“, „Fisher Scientific“, Waltham, MA, JAV), buvo įpilta maždaug 350–400 μl galvijų kraujo ir suaugusioms kirmėlėms leista nuvarvėti mažiausiai valandą. Tada vaikingoms patelėms buvo duodamas 10 % sacharozės tirpalas ir leista dėti ikrus ant drėgno filtro popieriaus, iškloto atskiruose itin skaidriuose suflė puodeliuose (1,25 skysčio uncijos dydžio, „Dart Container Corp.“, Masonas, MI, JAV). narvelį su vandeniu. Filtro popierių su ikrais sudėkite į sandarų maišelį („SC Johnsons“, Racine, WI) ir laikykite 26 °C temperatūroje. Ikrai buvo išperinti, o maždaug 200–250 lervų buvo užauginta plastikiniuose padėkluose su triušių ėdalo („ZuPreem“, „Premium Natural Products, Inc.“, Mission, KS, JAV), kepenų miltelių („MP Biomedicals, LLC“, Solonas, OH, JAV) ir žuvies filė („TetraMin“, „Tetra GMPH“, Meer, Vokietija) mišiniu santykiu 2:1:1. Mūsų biologiniuose tyrimuose buvo naudojamos vėlyvosios trečiosios stadijos lervos.
Šiame tyrime naudota augalų sėklų medžiaga buvo gauta iš šių komercinių ir vyriausybinių šaltinių: Brassica juncea (rudosios garstyčios – „Pacific Gold“) ir Brassica juncea (baltosios garstyčios – „Ida Gold“) iš „Pacific Northwest Farmers' Cooperative“, Vašingtono valstija, JAV; (sodinė pipirnė) iš „Kelly Seed and Hardware Co.“, Peorija, Ilinojus, JAV ir Thlaspi arvense (laukinė penipipirnė – „Elisabeth“) iš USDA-ARS, Peorija, Ilinojus, JAV; nė viena iš tyrime naudotų sėklų nebuvo apdorota pesticidais. Visa sėklų medžiaga buvo apdorota ir naudojama šiame tyrime laikantis vietinių ir nacionalinių taisyklių bei visų atitinkamų vietinių, valstijų ir nacionalinių taisyklių. Šiame tyrime nebuvo tiriamos transgeninės augalų veislės.
Brassica juncea (PG), liucernos (Ls), baltųjų garstyčių (IG) ir Thlaspi arvense (DFP) sėklos buvo sumaltos į smulkius miltelius naudojant Retsch ZM200 ultracentrifuginį malūną (Retsch, Haan, Vokietija) su 0,75 mm akučių akutėliu, nerūdijančio plieno rotoriumi, 12 dantų, 10 000 aps./min. (1 lentelė). Sumalti sėklų milteliai buvo perkelti į popierinį antgalį ir 24 val. Sokleto aparate nuriebalinti heksanu. Nuriebalintų lauko garstyčių mėginys buvo 1 val. termiškai apdorotas 100 °C temperatūroje, siekiant denatūruoti mirozinazę ir užkirsti kelią gliukozinolatų hidrolizei, kad susidarytų biologiškai aktyvūs izotiocianatai. Termiškai apdoroti asiūklio sėklų milteliai (DFP-HT) buvo naudojami kaip neigiama kontrolė, denatūruojanti mirozinazę.
Gliukozinolatų kiekis nuriebalintuose sėklų miltuose buvo nustatytas trimis egzemplioriais, naudojant efektyviąją skysčių chromatografiją (HPLC) pagal anksčiau paskelbtą protokolą64. Trumpai tariant, į 250 mg nuriebalintų sėklų miltelių mėginį buvo įpilta 3 ml metanolio. Kiekvienas mėginys buvo sonikuojamas vandens vonioje 30 minučių ir paliekamas tamsoje 23 °C temperatūroje 16 valandų. 1 ml organinio sluoksnio alikvotinė dalis buvo filtruojama per 0,45 μm filtrą į automatinį mėginių ėmiklį. Gliukozinolatų kiekis sėklų miltuose buvo nustatytas trimis egzemplioriais, naudojant „Shimadzu LC Solution“ programinę įrangą, 1.25 versiją („Shimadzu Corporation“, Kolumbija, Merilandas, JAV). Kolonėlė buvo C18 Inertsil atvirkštinės fazės kolonėlė (250 mm × 4,6 mm; RP C-18, ODS-3, 5u; GL Sciences, Torrance, CA, JAV). Pradinės mobiliosios fazės sąlygos buvo nustatytos kaip 12 % metanolio / 88 % 0,01 M tetrabutilamonio hidroksido vandenyje (TBAH; Sigma-Aldrich, Sent Luisas, MO, JAV), srauto greitis – 1 ml/min. Įšvirkštus 15 μl mėginio, pradinės sąlygos buvo palaikomos 20 minučių, o tada tirpiklio santykis buvo pakoreguotas iki 100 % metanolio, o bendras mėginio analizės laikas buvo 65 minutės. Standartinė kreivė (nM/mAb pagrindu) buvo gauta nuosekliai skiedžiant šviežiai paruoštus sinapino, gliukozinolato ir mirozino standartus (Sigma-Aldrich, Sent Luisas, MO, JAV), siekiant įvertinti sieros kiekį nuriebalintuose sėklų miltuose. Gliukozinolatų koncentracijos mėginiuose buvo nustatytos „Agilent 1100 HPLC“ aparatu („Agilent“, Santa Klara, Kalifornija, JAV), naudojant „OpenLAB CDS ChemStation“ versiją (C.01.07 SR2 [255]) su ta pačia kolonėle ir anksčiau aprašytu metodu. Gliukozinolatų koncentracijos buvo nustatytos; rezultatai turi būti palyginami skirtingose HPLC sistemose.
Alilo izotiocianatas (94 %, stabilus) ir benzilo izotiocianatas (98 %) buvo įsigyti iš „Fisher Scientific“ („Thermo Fisher Scientific“, Waltham, MA, JAV). 4-hidroksibenzilizotiocianatas buvo įsigytas iš „ChemCruz“ („Santa Cruz Biotechnology“, CA, JAV). Fermentiškai hidrolizuojami mirozinaze, gliukozinolatai, gliukozinolatai ir gliukozinolatai sudaro atitinkamai alilo izotiocianatą, benzilo izotiocianatą ir 4-hidroksibenzilizotiocianatą.
Laboratoriniai biologiniai tyrimai atlikti pagal Muturi ir kt. metodą 32 su modifikacijomis. Tyrime buvo naudoti penki mažai riebalų turintys sėklų pašarai: DFP, DFP-HT, IG, PG ir Ls. Dvidešimt lervų buvo patalpinta į 400 ml vienkartinę trijų pakopų menzūrą (VWR International, LLC, Radnor, PA, JAV), kurioje buvo 120 ml dejonizuoto vandens (dH2O). Buvo tiriamos septynios sėklų miltų koncentracijos, siekiant nustatyti toksiškumą uodų lervoms: 0,01, 0,02, 0,04, 0,06, 0,08, 0,1 ir 0,12 g sėklų miltų/120 ml dH2O DFP sėklų miltams, DFP-HT, IG ir PG. Preliminarūs biologiniai tyrimai rodo, kad nuriebalinti Ls sėklų miltai yra toksiškesni nei keturi kiti tirti sėklų miltai. Todėl septynias Ls sėklų miltų apdorojimo koncentracijas pakoregavome iki šių koncentracijų: 0,015, 0,025, 0,035, 0,045, 0,055, 0,065 ir 0,075 g/120 ml dH2O.
Neapdorota kontrolinė grupė (dH20, be sėklų miltų priedo) buvo įtraukta siekiant įvertinti normalų vabzdžių mirtingumą tyrimo sąlygomis. Kiekvieno sėklų milto toksikologiniai biologiniai tyrimai apėmė tris kartotines trijų nuolydžių menzūras (po 20 vėlyvosios trečiosios stadijos lervų vienoje menzūroje), iš viso 108 buteliukus. Apdoroti indai buvo laikomi kambario temperatūroje (20–21 °C), o lervų mirtingumas buvo registruojamas 24 ir 72 valandas nepertraukiamo veikimo apdorojimo koncentracijomis. Jei uodo kūnas ir galūnės nejuda, kai juos praduria ar liečia plona nerūdijančio plieno mentele, uodo lervos laikomos nejudančiomis. Negyvos lervos paprastai nejuda nugarinėje arba pilvo pusėje indo dugne arba vandens paviršiuje. Eksperimentas buvo pakartotas tris kartus skirtingomis dienomis, naudojant skirtingas lervų grupes, iš viso 180 lervų, veikiamų kiekviena apdorojimo koncentracija.
AITC, BITC ir 4-HBITC toksiškumas uodų lervoms buvo įvertintas naudojant tą pačią biologinio tyrimo procedūrą, bet su skirtingais apdorojimo būdais. Paruoškite 100 000 ppm kiekvienos cheminės medžiagos pradinius tirpalus, įpildami 100 µl cheminės medžiagos į 900 µl absoliutaus etanolio 2 ml centrifugos mėgintuvėlyje ir 30 sekundžių kratydami, kad gerai susimaišytų. Apdorojimo koncentracijos buvo nustatytos remiantis mūsų preliminariais biologiniais tyrimais, kurie parodė, kad BITC yra daug toksiškesnis nei AITC ir 4-HBITC. Toksiškumui nustatyti buvo naudojamos 5 BITC koncentracijos (1, 3, 6, 9 ir 12 ppm), 7 AITC koncentracijos (5, 10, 15, 20, 25, 30 ir 35 ppm) ir 6 4-HBITC koncentracijos (15, 15, 20, 25, 30 ir 35 ppm), 30, 45, 60, 75 ir 90 ppm). Kontroliniam apdorojimui buvo sušvirkšta 108 μL absoliutaus etanolio, kuris atitinka maksimalų cheminio apdorojimo tūrį. Biologiniai tyrimai buvo pakartoti kaip aprašyta aukščiau, iš viso apdorojant 180 lervų kiekviena apdorojimo koncentracija. Lervų mirtingumas buvo registruojamas kiekvienai AITC, BITC ir 4-HBITC koncentracijai po 24 valandų nepertraukiamo poveikio.
65 dozės priklausomo mirtingumo duomenų probitinė analizė atlikta naudojant „Polo“ programinę įrangą („Polo Plus“, „LeOra Software“, 1.0 versija), siekiant apskaičiuoti 50 % mirtiną koncentraciją (LC50), 90 % mirtiną koncentraciją (LC90), nuolydį, mirtinos dozės koeficientą ir 95 % mirtiną koncentraciją, remiantis logaritmiškai transformuotų koncentracijos ir dozės bei mirtingumo kreivių mirtinų dozių santykių patikimumo intervalais. Mirtingumo duomenys pagrįsti bendrais pakartotiniais 180 lervų, paveiktų kiekviena apdorojimo koncentracija, duomenimis. Tikimybinės analizės buvo atliktos atskirai kiekvienam sėklų miltui ir kiekvienam cheminiam komponentui. Remiantis mirtinos dozės santykio 95 % patikimumo intervalu, sėklų miltų ir cheminių sudedamųjų dalių toksiškumas uodų lervoms buvo laikomas reikšmingai skirtingu, todėl patikimumo intervalas, kurio vertė yra 1, reikšmingai nesiskyrė, P = 0,0566.
HPLC rezultatai, gauti nustatant pagrindinius gliukozinolatus nuriebalintuose sėklų miltuose DFP, IG, PG ir Ls, pateikti 1 lentelėje. Pagrindiniai gliukozinolatai tirtuose sėklų miltuose skyrėsi, išskyrus DFP ir PG, kuriuose abiejuose buvo mirozinazės gliukozinolatų. Mirozinino kiekis PG buvo didesnis nei DFP, atitinkamai 33,3 ± 1,5 ir 26,5 ± 0,9 mg/g. Ls sėklų milteliuose buvo 36,6 ± 1,2 mg/g gliukoglikono, o IG sėklų milteliuose – 38,0 ± 0,5 mg/g sinapino.
Ae. Aedes aegypti uodų lervos žuvo, kai buvo apdorotos riebalais be riebalų, nors apdorojimo veiksmingumas priklausė nuo augalo rūšies. Tik DFP-NT nebuvo toksiškas uodų lervoms po 24 ir 72 val. poveikio (2 lentelė). Veikliųjų sėklų miltelių toksiškumas didėjo didėjant koncentracijai (1A, B pav.). Sėklų miltų toksiškumas uodų lervoms reikšmingai skyrėsi, remiantis 95 % PI mirtinos dozės santykiu, lyginant LC50 vertes po 24 valandų ir 72 valandų vertinimų (3 lentelė). Po 24 valandų Ls sėklų miltų toksinis poveikis buvo didesnis nei kitų sėklų miltų apdorojimo būdų, pasižymintis didžiausiu aktyvumu ir maksimaliu toksiškumu lervoms (LC50 = 0,04 g/120 ml dH2O). Lervos po 24 valandų buvo mažiau jautrios DFP, palyginti su IG, Ls ir PG sėklų miltelių apdorojimais, o LC50 vertės buvo atitinkamai 0,115, 0,04 ir 0,08 g/120 ml dH2O, kurios buvo statistiškai didesnės nei LC50 vertė, lygi 0,211 g/120 ml dH2O (3 lentelė). DFP, IG, PG ir Ls LC90 vertės buvo atitinkamai 0,376, 0,275, 0,137 ir 0,074 g/120 ml dH2O (2 lentelė). Didžiausia DPP koncentracija buvo 0,12 g/120 ml dH2O. Po 24 valandų vertinimo vidutinis lervų mirtingumas buvo tik 12 %, o vidutinis IG ir PG lervų mirtingumas siekė atitinkamai 51 % ir 82 %. Po 24 valandų vertinimo vidutinis lervų mirtingumas, naudojant didžiausią Ls sėklų miltų koncentraciją (0,075 g/120 ml dH2O), buvo 99 % (1A pav.).
Mirtingumo kreivės buvo įvertintos pagal Ae. Egyptian lervos (3-ios stadijos lervos) dozės ir atsako (Probit) sąryšį su sėklų miltų koncentracija praėjus 24 valandoms (A) ir 72 valandoms (B) po apdorojimo. Taškinė linija žymi sėklų miltų apdorojimo LC50. DFP Thlaspi arvense, DFP-HT karščiu inaktyvuota Thlaspi arvense, IG Sinapsis alba (Ida Gold), PG Brassica juncea (Ramiojo vandenyno Gold), Ls Lepidium sativum.
72 valandų vertinimo metu DFP, IG ir PG sėklų miltų LC50 vertės buvo atitinkamai 0,111, 0,085 ir 0,051 g/120 ml dH2O. Beveik visos lervos, paveiktos Ls sėklų miltais, žuvo po 72 valandų poveikio, todėl mirtingumo duomenys neatitiko Probit analizės rezultatų. Palyginti su kitais sėklų miltais, lervos buvo mažiau jautrios DFP sėklų miltų apdorojimui ir turėjo statistiškai didesnes LC50 vertes (2 ir 3 lentelės). Po 72 valandų DFP, IG ir PG sėklų miltų apdorojimui skirtos LC50 vertės buvo atitinkamai 0,111, 0,085 ir 0,05 g/120 ml dH2O. Po 72 valandų vertinimo DFP, IG ir PG sėklų miltelių LC90 vertės buvo atitinkamai 0,215, 0,254 ir 0,138 g/120 ml dH2O. Po 72 valandų vertinimo vidutinis lervų mirtingumas apdorojus DFP, IG ir PG sėklų miltais, kurių maksimali koncentracija buvo 0,12 g/120 ml dH2O, buvo atitinkamai 58 %, 66 % ir 96 % (1B pav.). Po 72 valandų vertinimo nustatyta, kad PG sėklų miltai yra toksiškesni nei IG ir DFP sėklų miltai.
Sintetiniai izotiocianatai – alilizotiocianatas (AITC), benzilizotiocianatas (BITC) ir 4-hidroksibenzilizotiocianatas (4-HBITC) – gali veiksmingai naikinti uodų lervas. Praėjus 24 valandoms po apdorojimo, BITC buvo toksiškesnis lervoms, jo LC50 vertė buvo 5,29 ppm, palyginti su 19,35 ppm AITC atveju ir 55,41 ppm 4-HBITC atveju (4 lentelė). Palyginti su AITC ir BITC, 4-HBITC toksiškumas yra mažesnis, o LC50 vertė – didesnė. Dviejų pagrindinių izotiocianatų (Ls ir PG) toksiškumas uodų lervoms stipriausioje sėklų miltų formoje reikšmingai skiriasi. Toksiškumas, pagrįstas mirtinų dozių santykiu tarp LC50 verčių tarp AITC, BITC ir 4-HBITC, parodė statistinį skirtumą, kad 95 % PI LC50 mirtinų dozių santykio neapėmė 1 vertės (P = 0,05, 4 lentelė). Didžiausios BITC ir AITC koncentracijos, kaip apskaičiuota, sunaikino 100 % tirtų lervų (2 pav.).
Mirtingumo kreivės buvo įvertintos pagal Ae dozės ir atsako sąryšį (Probit). Praėjus 24 valandoms po apdorojimo, Egipto lervų (3-ios stadijos lervos) koncentracija pasiekė sintetinio izotiocianato koncentraciją. Taškinė linija žymi LC50 po apdorojimo izotiocianatu. Benzilo izotiocianatas BITC, alilo izotiocianatas AITC ir 4-HBITC.
Augalinių biopesticidų naudojimas kaip uodų pernešėjų kontrolės priemonių buvo jau seniai tiriamas. Daugelis augalų gamina natūralias chemines medžiagas, pasižyminčias insekticidiniu aktyvumu37. Jų bioaktyvūs junginiai yra patraukli alternatyva sintetiniams insekticidams, turintiems didelį potencialą kontroliuojant kenkėjus, įskaitant uodus.
Garstyčios auginamos dėl sėklų, naudojamos kaip prieskonis ir aliejaus šaltinis. Kai iš sėklų išgaunamas garstyčių aliejus arba kai garstyčios ekstrahuojamos naudoti kaip biokuras,69 šalutinis produktas yra nuriebalinti sėklų miltai. Šie sėklų miltai išlaiko daugelį natūralių biocheminių komponentų ir hidrolizės fermentų. Šių sėklų miltų toksiškumas siejamas su izotiocianatų gamyba55,60,61. Izotiocianatai susidaro hidrolizuojant gliukozinolatus fermentu mirozinaze sėklų miltų hidratacijos metu38,55,70 ir yra žinomi dėl fungicidinio, baktericidinio, nematocidinio ir insekticidinio poveikio, taip pat kitų savybių, įskaitant cheminį sensorinį poveikį ir chemoterapines savybes61,62,70. Keletas tyrimų parodė, kad garstyčių augalai ir sėklų miltai veiksmingai veikia kaip fumigantai nuo dirvožemio ir laikomų maisto produktų kenkėjų57,59,71,72. Šiame tyrime įvertinome keturių sėklų miltų ir trijų jų bioaktyviųjų produktų AITC, BITC ir 4-HBITC toksiškumą Aedes uodų lervoms. Aedes aegypti. Tikimasi, kad sėklų miltų įdėjimas tiesiai į vandenį, kuriame yra uodų lervų, suaktyvins fermentinius procesus, kurie gamina uodų lervoms toksiškus izotiocianatus. Ši biotransformacija iš dalies buvo įrodyta pastebėtu sėklų miltų larvicidiniu aktyvumu ir insekticidinio aktyvumo praradimu, kai nykštukinių garstyčių sėklų miltai buvo termiškai apdoroti prieš naudojimą. Tikimasi, kad terminis apdorojimas sunaikins hidrolizės fermentus, kurie aktyvuoja gliukozinolatus, taip užkertant kelią bioaktyvių izotiocianatų susidarymui. Tai pirmasis tyrimas, patvirtinantis kopūstų sėklų miltelių insekticidines savybes nuo uodų vandens aplinkoje.
Iš tirtų sėklų miltelių toksiškiausi buvo vandenkresės sėklų milteliai (Ls), sukeldami didelį Aedes albopictus mirtingumą. Aedes aegypti lervos buvo apdorojamos nepertraukiamai 24 valandas. Likę trys sėklų milteliai (PG, IG ir DFP) pasižymėjo lėtesniu aktyvumu ir vis tiek sukėlė didelį mirtingumą po 72 valandų nepertraukiamo apdorojimo. Tik Ls sėklų miltuose buvo didelis gliukozinolatų kiekis, tuo tarpu PG ir DFP sudėtyje buvo mirozinazė, o IG – gliukozinolatas kaip pagrindinis gliukozinolatas (1 lentelė). Gliukotropaeolinas hidrolizuojamas į BITC, o sinalbinas hidrolizuojamas į 4-HBITC61,62. Mūsų biologinio tyrimo rezultatai rodo, kad tiek Ls sėklų miltai, tiek sintetinis BITC yra labai toksiški uodų lervoms. Pagrindinis PG ir DFP sėklų miltų komponentas yra mirozinazės gliukozinolatas, kuris hidrolizuojamas į AITC. AITC veiksmingai naikina uodų lervas, jo LC50 vertė yra 19,35 ppm. Palyginti su AITC ir BITC, 4-HBITC izotiocianatas yra mažiausiai toksiškas lervoms. Nors AITC yra mažiau toksiškas nei BITC, jų LC50 vertės yra mažesnės nei daugelio eterinių aliejų, išbandytų su uodų lervomis32,73,74,75.
Mūsų kryžmažiedžių sėklų milteliai, skirti naudoti nuo uodų lervų, turi vieną pagrindinį gliukozinolatą, kuris, nustatyta HPLC metodu, sudaro daugiau kaip 98–99 % visų gliukozinolatų. Aptikta kitų gliukozinolatų pėdsakų, tačiau jų kiekis sudarė mažiau nei 0,3 % visų gliukozinolatų. Pipirnės (L. sativum) sėklų milteliuose yra antrinių gliukozinolatų (sinigrino), tačiau jų dalis sudaro 1 % visų gliukozinolatų ir vis tiek yra nereikšminga (apie 0,4 mg/g sėklų miltelių). Nors PG ir DFP sudėtyje yra tas pats pagrindinis gliukozinolatas (mirozinas), jų sėklų miltų larvicidinis aktyvumas labai skiriasi dėl jų LC50 verčių. Toksiškumas miltligei skiriasi. Aedes aegypti lervų atsiradimas gali būti susijęs su mirozinazės aktyvumo arba stabilumo skirtumais tarp dviejų sėklų pašarų. Mirozinazės aktyvumas vaidina svarbų vaidmenį hidrolizės produktų, tokių kaip izotiocianatai, biologiniam prieinamumui Brassicaceae augaluose76. Ankstesnėse Pocock ir kt.77 ir Wilkinson ir kt.78 ataskaitose teigiama, kad mirozinazės aktyvumo ir stabilumo pokyčiai taip pat gali būti susiję su genetiniais ir aplinkos veiksniais.
Laukiamas bioaktyvaus izotiocianato kiekis buvo apskaičiuotas remiantis kiekvienų sėklų miltų LC50 vertėmis po 24 ir 72 valandų (5 lentelė), siekiant palyginti su atitinkamais cheminių medžiagų panaudojimais. Po 24 valandų sėklų miltuose esantys izotiocianatai buvo toksiškesni nei gryni junginiai. LC50 vertės, apskaičiuotos remiantis izotiocianatų sėklų apdorojimo miltelių milijoninėmis dalimis (ppm), buvo mažesnės nei LC50 vertės, gautos naudojant BITC, AITC ir 4-HBITC. Stebėjome, kad lervos ėda sėklų miltų granules (3A pav.). Todėl lervos, prarydamos sėklų miltų granules, gali gauti didesnį koncentruotą toksiškų izotiocianatų poveikį. Tai labiausiai pasireiškė IG ir PG sėklų miltų apdorojimo miltelių 24 valandų poveikio metu, kai LC50 koncentracijos buvo atitinkamai 75 % ir 72 % mažesnės nei gryno AITC ir 4-HBITC apdorojimo miltelių. Ls ir DFP apdorojimo milteliai buvo toksiškesni nei grynas izotiocianatas, kurių LC50 vertės buvo atitinkamai 24 % ir 41 % mažesnės. Kontrolinio apdorojimo lervos sėkmingai išsivystė į lėliukes (3B pav.), o dauguma lervų, patekusių į sėklų miltus, nesuformavo lėliukės ir lervų vystymasis buvo žymiai sulėtėjęs (3B, D pav.). Spodopteralitura atveju izotiocianatai siejami su augimo sulėtėjimu ir vystymosi sulėtėjimu79.
Ae. Aedes aegypti uodų lervos 24–72 valandas buvo nuolat veikiamos Brassica sėklų milteliais. (A) Negyvos lervos su sėklų miltų dalelėmis burnos organuose (apibraukta); (B) Kontrolinis gydymas (dH20 be pridėtų sėklų miltų) rodo, kad lervos auga normaliai ir pradeda lėliuotis po 72 valandų. (C, D) Lervos, paveiktos sėklų miltais; sėklų miltai parodė vystymosi skirtumus ir nesulėtėjo.
Mes netyrėme izotiocianatų toksinio poveikio uodų lervoms mechanizmo. Tačiau ankstesni tyrimai su raudonosiomis ugninėmis skruzdėlėmis (Solenopsis invicta) parodė, kad glutationo S-transferazės (GST) ir esterazės (EST) slopinimas yra pagrindinis izotiocianatų biologinio aktyvumo mechanizmas, o AITC, net ir esant mažam aktyvumui, taip pat gali slopinti GST aktyvumą. Mažos koncentracijos importuotos raudonosios ugninės skruzdėlės. Dozė yra 0,5 µg/ml80. Priešingai, AITC slopina acetilcholinesterazę suaugusių kukurūzinių straubliukų (Sitophilus zeamais) organizme81. Panašius tyrimus reikia atlikti siekiant išsiaiškinti izotiocianatų aktyvumo mechanizmą uodų lervoms.
Siekdami pagrįsti teiginį, kad augalinių gliukozinolatų hidrolizė, susidarant reaktyviems izotiocianatams, yra uodų lervų kontrolės mechanizmas, naudojant garstyčių sėklų miltus, naudojame termiškai inaktyvuotą DFP apdorojimą. DFP-HT sėklų miltai nebuvo toksiški, esant išbandytoms naudojimo normoms. Lafarga ir kt. 82 pranešė, kad gliukozinolatai yra jautrūs skaidymui aukštoje temperatūroje. Taip pat tikimasi, kad terminis apdorojimas denatūruos mirozinazės fermentą sėklų miltuose ir neleis gliukozinolatams hidrolizuotis, susidarant reaktyviems izotiocianatams. Tai patvirtino ir Okunade ir kt. 75, kurie parodė, kad mirozinazė yra jautri temperatūrai, parodydami, kad mirozinazės aktyvumas buvo visiškai inaktyvuotas, kai garstyčių, juodųjų garstyčių ir kraujinių garstyčių sėklos buvo veikiamos aukštesnėje nei 80 °C temperatūroje. Šie mechanizmai gali lemti termiškai apdorotų DFP sėklų miltų insekticidinio aktyvumo praradimą.
Taigi, garstyčių sėklų miltai ir trys pagrindiniai jų izotiocianatai yra toksiški uodų lervoms. Atsižvelgiant į šiuos skirtumus tarp sėklų miltų ir cheminių apdorojimo, sėklų miltų naudojimas gali būti veiksmingas uodų kontrolės metodas. Reikia nustatyti tinkamas formules ir veiksmingas tiekimo sistemas, siekiant pagerinti sėklų miltelių naudojimo veiksmingumą ir stabilumą. Mūsų rezultatai rodo, kad garstyčių sėklų miltai gali būti naudojami kaip alternatyva sintetiniams pesticidams. Ši technologija galėtų tapti novatoriška priemone uodų pernešėjams kontroliuoti. Kadangi uodų lervos klesti vandens aplinkoje, o sėklų miltų gliukozinolatai hidratacijos metu fermentų būdu paverčiami aktyviais izotiocianatais, garstyčių sėklų miltų naudojimas uodų užkrėstame vandenyje suteikia didelį kontrolės potencialą. Nors izotiocianatų larvicidinis aktyvumas skiriasi (BITC > AITC > 4-HBITC), reikia atlikti daugiau tyrimų, siekiant nustatyti, ar sėklų miltų derinimas su keliais gliukozinolatais sinergiškai padidina toksiškumą. Tai pirmasis tyrimas, parodantis nuriebalintų kryžmažiedžių sėklų miltų ir trijų bioaktyvių izotiocianatų insekticidinį poveikį uodams. Šio tyrimo rezultatai atveria naują kelią, parodydami, kad riebaluoti kopūstų sėklų miltai, gaunami iš sėklų išgaunant aliejų, gali būti perspektyvus larvicidinis agentas uodams kontroliuoti. Ši informacija gali padėti toliau atrasti augalų biokontrolės agentus ir juos kurti kaip pigius, praktiškus ir aplinkai nekenksmingus biopesticidus.
Šiam tyrimui sugeneruotus duomenų rinkinius ir atliktas analizes galima gauti iš atitinkamo autoriaus pateikus pagrįstą prašymą. Tyrimo pabaigoje visos tyrime naudotos medžiagos (vabzdžiai ir sėklų miltai) buvo sunaikintos.
Įrašo laikas: 2024 m. liepos 29 d.