Dėkojame, kad apsilankėte Nature.com.Naudojama naršyklės versija turi ribotą CSS palaikymą.Siekiant geriausių rezultatų, rekomenduojame naudoti naujesnę naršyklės versiją (arba išjungti suderinamumo režimą „Internet Explorer“).Tuo tarpu, norėdami užtikrinti nuolatinį palaikymą, svetainę rodome be stiliaus ar JavaScript.
Natūralių produktų atradimas ir naudingas naudojimas gali padėti pagerinti žmogaus gyvenimą.Augalų augimą slopinančios cheminės medžiagos plačiai naudojamos kaip herbicidai naikinti piktžoles.Dėl būtinybės naudoti įvairių tipų herbicidus, reikia nustatyti junginius su naujais veikimo mechanizmais.Šiame tyrime mes atradome naują N-alkoksipirolio junginį, kumamonamidą, iš Streptomyces werraensis MK493-CF1 ir nustatėme visą sintezės procesą.Atlikdami biologinio aktyvumo tyrimus, išsiaiškinome, kad urs-monoamino rūgštis yra sintetinis urs-monoamido tarpinis produktas ir potencialusaugalų augimo inhibitorius.Be to, sukūrėme įvairių urbenono rūgšties darinių, įskaitant urbeniloksi darinį (UDA), kuris pasižymi dideliu herbicidiniu aktyvumu, nedarant neigiamos įtakos HeLa ląstelių augimui.Taip pat nustatėme, kad urmotoninės rūgšties dariniai ardo augalų mikrovamzdelius;be to, KAND veikia aktino gijas ir sukelia ląstelių mirtį;Šis daugialypis poveikis skiriasi nuo žinomų mikrotubulių inhibitorių poveikio ir rodo naują ursono rūgšties veikimo mechanizmą, kuris yra svarbus pranašumas kuriant naujus herbicidus.
Naudingų natūralių produktų ir jų darinių atradimas ir praktinis pritaikymas yra priemonė pagerinti žmogaus gyvenimo kokybę.Antriniai metabolitai, kuriuos gamina mikroorganizmai, augalai ir vabzdžiai, padarė didelę pažangą medicinoje ir žemės ūkyje.Daugelis antibiotikų ir vaistų nuo leukemijos buvo sukurti iš natūralių produktų.Be to, įvairių rūšiųpesticidai, iš šių natūralių produktų išgaunami fungicidai ir herbicidai, skirti naudoti žemės ūkyje.Visų pirma, piktžolių kontrolės herbicidai yra svarbios priemonės didinant pasėlių derlių šiuolaikiniame žemės ūkyje, o įvairių rūšių junginiai jau naudojami komercinėje veikloje.Kai kurie augalų ląstelių procesai, tokie kaip fotosintezė, aminorūgščių metabolizmas, ląstelės sienelės sintezė, mitozės reguliavimas, fitohormonų signalizacija arba baltymų sintezė, yra laikomi tipiniais herbicidų taikiniais.Junginiai, slopinantys mikrovamzdelių funkciją, yra dažna herbicidų klasė, kuri veikia augalų augimą, paveikdama mitozinį reguliavimą2.
Mikrotubulai yra citoskeleto komponentai ir yra plačiai konservuoti eukariotinėse ląstelėse.Tubulino heterodimeras susideda iš α-tubulino ir β-tubulino, sudarančių linijinius mikrovamzdelių protofilamentus, o 13 protofilamentų sudaro cilindrinę struktūrą.Mikrovamzdeliai atlieka daugybę vaidmenų augalų ląstelėse, įskaitant ląstelių formos nustatymą, ląstelių dalijimąsi ir tarpląstelinį transportą3,4.Augalų ląstelėse yra mikrotubulių, esančių po tarpfaze plazmos membrana, ir manoma, kad šie vadinamieji žievės mikrovamzdeliai kontroliuoja celiuliozės mikrofibrilių organizaciją, reguliuodami celiuliozės sintazės kompleksus4,5.Šaknies epidermio ląstelių žievės mikrovamzdeliai, esantys spartaus šaknies galiuko pailgėjimo zonoje, yra išsidėstę šonuose, o celiuliozės mikropluoštai seka šiuos mikrovamzdelius ir riboja ląstelių plėtimosi kryptį, taip skatindami anizotropinį ląstelių pailgėjimą.Todėl mikrotubulų funkcija yra glaudžiai susijusi su augalų morfologija.Amino rūgščių pakaitalai genuose, koduojančiuose tubuliną, sukelia žievės mikrotubulų masyvų iškrypimą ir augimą kairėje arba dešinėje Arabidopsis 6, 7.Panašiai su mikrotubuliais susijusių baltymų, reguliuojančių mikrotubulų dinamiką, mutacijos taip pat gali sukelti iškreiptą šaknų augimą 8, 9, 10, 11, 12, 13.Be to, gydymas mikrovamzdelius ardančiais herbicidais, tokiais kaip dizopiramidas, taip pat žinomas kaip pretilachloras, taip pat sukelia kairiųjų įstrižų šaknų augimą14.Šie duomenys rodo, kad norint nustatyti augalų augimo kryptį, labai svarbu tiksliai reguliuoti mikrotubulų funkciją.
Buvo atrasta įvairių tipų mikrotubulių inhibitorių, ir šie vaistai labai prisidėjo prie citoskeleto tyrimų, taip pat į žemės ūkį ir mediciną2.Visų pirma, orizalinas, dinitroanilino junginiai, dizopiramidas, su benzamidu susiję junginiai ir jų analogai gali slopinti mikrotubulų funkciją ir taip slopinti augalų augimą.Todėl jie plačiai naudojami kaip herbicidai.Tačiau kadangi mikrovamzdeliai yra svarbi augalų ir gyvūnų ląstelių sudedamoji dalis, dauguma mikrotubulių inhibitorių yra citotoksiški abiejų tipų ląstelėms.Todėl, nepaisant pripažinto jų, kaip herbicidų, naudingumo, praktiniais tikslais naudojamas ribotas skaičius antimikrotubulinių medžiagų.
Streptomyces yra Streptomyces šeimos gentis, kuriai priklauso aerobinės, gramteigiamos, siūlinės bakterijos ir yra plačiai žinoma dėl savo gebėjimo gaminti daugybę antrinių metabolitų.Todėl jis laikomas vienu svarbiausių naujų biologiškai aktyvių natūralių produktų šaltinių.Šiame tyrime aptikome naują junginį, vadinamą kumamonamidu, kuris buvo išskirtas iš Streptomyces werraensis MK493-CF1 ir S. werraensis ISP 5486. Naudojant spektrinę analizę ir visą spektrinę analizę, buvo apibūdinta kumamonamido struktūra ir jo unikalus N-alkoksipirolio skeletas. buvo pasiryžęs.sintezė.Nustatyta, kad ursmono rūgštis, sintetinė ursmonoamido ir jo darinių tarpinė medžiaga, slopina populiaraus pavyzdinio augalo Arabidopsis thaliana augimą ir daigumą.Atlikdami struktūros ir veiklos santykio tyrimą, nustatėme, kad junginys su C9, modifikuotu į ursono rūgštį, vadinamas ursono rūgšties noniloksi dariniu (KAND), žymiai sustiprina slopinamąjį poveikį augimui ir daigumui.Pažymėtina, kad naujai atrastas augalų augimo inhibitorius taip pat paveikė tabako ir kepenėlių augimą ir nebuvo citotoksiškas bakterijoms ar HeLa ląstelėms.Be to, kai kurie urmotoninės rūgšties dariniai sukelia iškreiptą šaknies fenotipą, o tai reiškia, kad šie dariniai tiesiogiai arba netiesiogiai veikia mikrotubulus.Remiantis šia idėja, mūsų stebėjimai apie mikrotubulus, pažymėtus imunohistochemiškai arba fluorescenciniais baltymais, rodo, kad gydymas KAND depolimerizuoja mikrotubulus.Be to, gydant kumamotono rūgšties dariniais, buvo pažeisti aktino mikrofilamentai.Taigi mes atradome naują augalų augimo inhibitorių, kurio unikalus veikimo mechanizmas yra susijęs su citoskeleto sunaikinimu.
Padermė MK493-CF1 buvo išskirta iš dirvožemio Shinagawa-ku, Tokijuje.Padermė MK493-CF1 sudarė gerai išsišakojusią stromos micelį.Nustatyta dalinė 16S ribosominės RNR geno seka (1422 bp).Ši padermė labai panaši į S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: tipinė padermė, 99,93%).Remiantis šiuo rezultatu, buvo nustatyta, kad ši padermė buvo glaudžiai susijusi su S. werraensis tipo štamu.Todėl šią padermę laikinai pavadinome S. werraensis MK493-CF1.S. werraensis ISP 5486T taip pat gamina tuos pačius biologiškai aktyvius junginius.Kadangi ankstyvųjų tyrimų, kaip gauti natūralių produktų iš šio mikroorganizmo, buvo mažai, buvo atlikti tolesni cheminiai tyrimai.Po S. werraensis MK493-CF1 kultivavimo miežių terpėje kietosios būsenos fermentacijos būdu 30°C temperatūroje 14 dienų, terpė ekstrahuota 50 % EtOH.60 ml mėginio išdžiovinta, kad gautų 59,5 mg neapdoroto ekstrakto.Neapdorotas ekstraktas buvo atliktas atvirkštinės fazės HPLC, kad gautų N-metoksi-1H-pirol-2-karboksamidą (1, pavadintas kumamonamidu, 36,0 mg).Bendras 1 kiekis sudaro apie 60 % neapdoroto ekstrakto.Todėl nusprendėme išsamiai ištirti kumamotoamido 1 savybes.
Coumamonamid 1 yra balti amorfiniai milteliai, o didelės skiriamosios gebos masės spektrometrija (HRESIMS) patvirtina C6H8N2O2 (1 pav.).Šio junginio C2 pakeisto pirolio fragmentas pasižymi δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH 1H BMR spektre: 4,5 Hz , H-5) ir δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), o 13C BMR spektras rodo keturių sp2 anglies atomų buvimą.Amido grupės buvimas C2 padėtyje buvo įvertintas HMBC koreliacija nuo C-3 protono iki amido karbonilo anglies, kai δC 161,1.Be to, 1H ir 13C BMR smailės ties δH 4,10 (3H, S) ir δC 68,3 rodo N-metoksi grupių buvimą molekulėje.Nors teisinga metoksi grupės padėtis dar nebuvo nustatyta naudojant spektroskopinę analizę, tokią kaip patobulinta skirtumo spektroskopija ir branduolio Overhauserio santrumpa (NOEDF), N-metoksi-1H-pirolio-2-karboksamidas tapo pirmuoju kandidatu į junginį.
Norint nustatyti teisingą 1 struktūrą, buvo atlikta visuminė sintezė (2a pav.).Prekyboje prieinamą 2-aminopiridiną 2 apdorojant m-CPBA, gaunamas atitinkamas N-oksidas 3 kiekybiškai.Po 2-aminoazidinimo, Abramovičiaus aprašyta ciklokondensacijos reakcija buvo atlikta benzene 90 °C temperatūroje, kad gautų norimą 1-hidroksi-1H-pirol-2-karbonitrilą 5 gramais.Greitis 60% (du etapai).15,16.Metilinant ir hidrolizavus 4, gauta 1-metoksi-1H-pirol-2-karboksirūgštis (vadinama „kumotono rūgštimi“, 6) gera išeiga (70%, du etapai).Galiausiai, amidinant per tarpinį 6 rūgšties chlorido produktą, naudojant vandeninį amoniaką, buvo gautas Kumamoto amidas 1 98% išeiga.Visi susintetinto 1 spektriniai duomenys buvo panašūs į izoliuoto 1, todėl buvo nustatyta 1 struktūra;
Bendra urbenamido ir urbeno rūgšties biologinio aktyvumo sintezė ir analizė.a ) Visa Kumamoto amido sintezė.( b ) Septynių dienų laukinio tipo Arabidopsis Columbia (Col) sodinukai buvo auginami Murashige ir Skoog (MS) lėkštelėse, kuriose buvo nurodytos koncentracijos kumamonamidas 6 arba kumamonamidas 1.Mastelio juosta = 1 cm.
Pirma, mes įvertinome urbenamido ir jo tarpinių produktų biologinį aktyvumą, kad jie galėtų moduliuoti augalų augimą.Į MS agaro terpę įdėjome įvairių koncentracijų ursmonamido 1 arba ursmono rūgšties 6 ir šioje terpėje auginome Arabidopsis thaliana sodinukus.Šie tyrimai parodė, kad didelės koncentracijos (500 μM) 6 slopina šaknų augimą (2b pav.).Toliau sugeneravome įvairius darinius, pakeisdami N1 padėtį 6 ir atlikome jų struktūros ir veiklos santykio tyrimus (analogų sintezės procesas aprašytas pagalbinėje informacijoje (SI)).Arabidopsis daigai buvo auginami terpėje, kurioje buvo 50 μM ursono rūgšties darinių, ir išmatuotas šaknų ilgis.kaip parodyta paveikslėlyje.Kaip parodyta 3a, b ir S1 paveiksluose, kumamo rūgštys turi skirtingo ilgio linijines alkoksi grandines (9, 10, 11, 12 ir 13) arba dideles alkoksi grandines (15, 16 ir 17) N1 padėtyje.Dariniai parodė reikšmingą šaknų augimo slopinimą.Be to, mes nustatėme, kad 200 μM 10, 11 arba 17 naudojimas slopino daigumą (3c ir S2 pav.).
Kumamoto amido ir susijusių junginių struktūros ir aktyvumo ryšio tyrimas.a) Analogų sandara ir sintezės schema.b ) 7 dienų amžiaus sodinukų, auginamų MS terpėje su 50 μM kumamonamido dariniais arba be jų, šaknų ilgio kiekybinis įvertinimas.Žvaigždutės rodo reikšmingus skirtumus, susijusius su apgaulingu gydymu (t testas, p< 0,05).n>18. Duomenys rodomi kaip vidurkis ± SD.nt reiškia „neišbandyta“, nes daugiau nei 50% sėklų nesudygo.c) Kiekybinis apdorotų sėklų, inkubuotų 7 dienas MS terpėje su 200 μM kumamonamidu ir susijusiais junginiais, daigumo greičio kiekybinis įvertinimas.Žvaigždutės rodo reikšmingus skirtumus taikant netikrą gydymą (chi kvadrato testas).n = 96.
Įdomu tai, kad pridėjus alkilo šonines grandines, ilgesnes nei C9, slopinamasis aktyvumas sumažėjo, o tai rodo, kad su kumamotoine rūgštimi susiję junginiai reikalauja tam tikro dydžio šoninių grandinių, kad būtų parodytas jų biologinis aktyvumas.
Kadangi struktūros ir aktyvumo ryšio analizė parodė, kad C9 buvo modifikuotas į ursono rūgštį, o ursono rūgšties noniloksi darinys (toliau – KAND 11) buvo veiksmingiausias augalų augimo inhibitorius, atlikome išsamesnį KAND 11 apibūdinimą. Arabidopsis gydymas. su 50 μM KAND 11 beveik visiškai neleido dygti, o mažesnės koncentracijos (40, 30, 20 arba 10 μM) KAND 11 slopino šaknų augimą priklausomai nuo dozės (4a, b pav.).Norėdami patikrinti, ar KAND 11 veikia šaknų meristemų gyvybingumą, ištyrėme propidžio jodidu (PI) nudažytas šaknų meristemas ir išmatavome meristemų plotą.Sėjinukų, išaugintų terpėje, kurioje yra 25 μM KAND-11, meristemos dydis buvo 151,1 ± 32,5 μm, o sodinukų, išaugintų ant kontrolinės terpės, kurioje yra DMSO, meristemos dydis buvo 264,7 ± 30,8 μm, (4c pav.) , o tai rodo, kad KAND-11 atkuria ląstelių aktyvumą.plinta.Šaknies meristema.Atsižvelgiant į tai, gydymas KAND 11 sumažino ląstelių dalijimosi žymens CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS signalą šaknies meristemoje (4e pav.) 17 .Šie rezultatai rodo, kad KAND 11 slopina šaknų augimą, sumažindamas ląstelių proliferacijos aktyvumą.
Urbenono rūgšties darinių (urbeniloksi darinių) slopinamojo poveikio augimui analizė.(a) 7 dienų laukinio tipo Col daigai, auginami MS lėkštelėse su nurodytomis KAND 11 koncentracijomis. Mastelio juosta = 1 cm.b) šaknies ilgio kiekybinis nustatymas.Raidės rodo reikšmingus skirtumus (Tukey HSD testas, p< 0,05).n>16. Duomenys rodomi kaip vidurkis ± SD.c) Propidio jodidu dažytų laukinio tipo Col šaknų, išaugintų MS plokštelėse su 25 μM KAND 11 arba be jo, konfokalinė mikroskopija. Baltos skliausteliuose nurodoma šaknų meristema.Mastelio juosta = 100 µm.d) šaknies meristemos dydžio kiekybinis įvertinimas (n = 10–11).Statistiniai skirtumai buvo nustatyti naudojant t testą (p< 0,05).Juostos rodo vidutinį meristemos dydį.e) šaknies meristemos, turinčios CDKB2 konstrukciją, diferencialinio interferencinio kontrasto (DIC) mikroskopija;1pro: CDKB2;1-GUS nudažytas ir nudažytas ant 5 dienų amžiaus daigų, auginamų MS plokštelėse su 25 µM KAND tyrimu arba be jo.
KAND 11 fitotoksiškumas buvo toliau tiriamas naudojant kitą dviskiltį augalą – tabaką (Nicotiana tabacum) ir pagrindinį sausumos augalų pavyzdinį organizmą – kepenėles (Marchantia polymorpha).Kaip ir Arabidopsis atveju, tabako SR-1 daigai, auginami terpėje, kurioje yra 25 μM KAND 11, išaugino trumpesnes šaknis (5a pav.).Be to, 40 iš 48 sėklų sudygo lėkštelėse, kuriose yra 200 μM KAND 11, tuo tarpu visos 48 sėklos sudygo ant imitacinės terpės, o tai rodo, kad didesnės KAND koncentracijos buvo reikšmingos (p.< 0,05;chi testas -kvadratas) slopino tabako daigumą.(5b pav.).Be to, KAND 11 koncentracija, kuri slopino bakterijų augimą kepenyse, buvo panaši į veiksmingą Arabidopsis koncentraciją (5c pav.).Šie rezultatai rodo, kad KAND 11 gali slopinti įvairių augalų augimą.Tada ištyrėme galimą su lokio monoamidu susijusių junginių citotoksiškumą kituose organizmuose, būtent žmogaus HeLa ląstelėse ir Escherichia coli štamą DH5α, kaip aukštesnių gyvūnų ir bakterijų ląstelių atstovus.Atlikdami daugybę ląstelių proliferacijos tyrimų, pastebėjome, kad 100 μM koncentracijos kumamonamidas 1, kumamonamido rūgštis 6 ir KAND 11 neturėjo įtakos HeLa arba E. coli ląstelių augimui (5d, e pav.).
KAND 11 augimo slopinimas ne Arabidopsis organizmuose.(a) Dviejų savaičių amžiaus laukinio tipo SR-1 tabako daigai buvo auginami vertikaliai išdėstytose MS lėkštelėse, kuriose buvo 25 μM KAND 11. (b) Dviejų savaičių amžiaus laukinio tipo SR-1 tabako daigai buvo auginami ant horizontalios padėties. MS plokštelės, kuriose yra 200 μM KAND 11. (c) Dviejų savaičių laukinio tipo Tak-1 kepenėlių pumpurai, auginami Gamborg B5 plokštelėse su nurodytomis KAND 11 koncentracijomis. Raudonos rodyklės rodo sporas, kurios nustojo augti per dvi savaites trukusią inkubaciją laikotarpį.(d) HeLa ląstelių ląstelių proliferacijos tyrimas.Gyvybingų ląstelių skaičius buvo matuojamas fiksuotais laiko intervalais, naudojant ląstelių skaičiavimo rinkinį 8 (Dojindo).Kaip kontrolė, HeLa ląstelės buvo apdorotos 5 μg / ml aktinomicino D (Act D), kuris slopina RNR polimerazės transkripciją ir sukelia ląstelių mirtį.Analizės buvo atliekamos trimis egzemplioriais.e) E. coli ląstelių proliferacijos tyrimas.E. coli augimas buvo analizuojamas matuojant OD600.Kaip kontrolė, ląstelės buvo apdorotos 50 μg/ml ampicilinu (Amp), kuris slopina bakterijų ląstelių sienelių sintezę.Analizės buvo atliekamos trimis egzemplioriais.
Norėdami iššifruoti su uramidu susijusių junginių sukeliamo citotoksiškumo veikimo mechanizmą, iš naujo išanalizavome urbeno rūgšties darinius, turinčius vidutinio slopinimo poveikį.kaip parodyta paveikslėlyje.Kaip parodyta 2b, 6a paveiksluose, daigai, auginami agaro lėkštelėse, kuriose yra didelės koncentracijos (200 μM) urmotoninės rūgšties 6, išaugino trumpesnes ir į kairę išlenktas šaknis (θ = – 23,7 ± 6,1), o daigų, auginamų ant kontrolinės terpės, daigų išaugino beveik tiesias šaknis (θ = – 3,8 ± 7,1).Žinoma, kad šis būdingas įstrižas augimas atsiranda dėl žievės mikrotubulių disfunkcijos 14, 18.Remiantis šia išvada, mikrovamzdelius destabilizuojantys vaistai dizopiramidas ir orizalinas mūsų augimo sąlygomis sukėlė panašų šaknų pakrypimą (2b, 6a pav.).Tuo pačiu metu išbandėme urmotoninės rūgšties darinius ir atrinkome keletą jų, kurie tam tikromis koncentracijomis paskatino įstrižų šaknų augimą.8, 9 ir 15 junginiai pakeitė šaknų augimo kryptį atitinkamai esant 75 μM, 50 μM ir 40 μM, o tai rodo, kad šie junginiai gali veiksmingai destabilizuoti mikrovamzdelius (2b pav., 6a).Mes taip pat išbandėme stipriausią ursolio rūgšties darinį KAND 11, esant mažesnei koncentracijai (15 µM), ir nustatėme, kad KAND 11 naudojimas slopina šaknų augimą ir kad šaknų augimo kryptis buvo netolygi, nors jos linkusios svyruoti į kairę ( C3 pav.)..Kadangi didesnės mikrovamzdelius destabilizuojančių vaistų koncentracijos kartais slopina augalų augimą, o ne sukelia šaknų pakreipimą, vėliau įvertinome galimybę, kad KAND 11 paveikia mikrovamzdelius, stebėdami žievės mikrotubulus šaknų epidermio ląstelėse.Imunohistochemija naudojant anti-β-tubulino antikūnus sėjinukų šaknų, apdorotų 25 μM KAND 11, epidermio ląstelėse, parodė, kad pailgėjimo zonoje epidermio ląstelėse išnyko beveik visi žievės mikrotubulai (6b pav.).Šie rezultatai rodo, kad kumamotono rūgštis ir jos dariniai tiesiogiai arba netiesiogiai veikia mikrotubulus, kad juos suardytų, ir kad šie junginiai yra nauji mikrotubulių inhibitoriai.
Ursono rūgštis ir jos dariniai keičia Arabidopsis thaliana žievės mikrotubulus.a ) Šaknies polinkio kampas, išmatuotas esant įvairiems urmotono rūgšties dariniams esant nurodytoms koncentracijoms.Taip pat buvo analizuojamas dviejų junginių, kurie, kaip žinoma, slopina mikrovamzdelius: dizopiramido ir orizalino, poveikis.Įdėklas rodo standartą, naudojamą šaknies augimo kampui matuoti.Žvaigždutės rodo reikšmingus skirtumus, susijusius su apgaulingu gydymu (t testas, p< 0,05).n>19. Mastelio juosta = 1 cm.b ) Žievės mikrotubulai epidermio ląstelėse pailgėjimo zonoje.Mikrotubulai laukinio tipo Arabidopsis Col šaknyse, auginamose MS plokštelėse su 25 μM KAND 11 arba be jo, buvo vizualizuoti imunohistocheminiu dažymu, naudojant β-tubulino pirminius antikūnus ir Alexa Fluor konjuguotus antrinius antikūnus.Mastelio juosta = 10 µm.c ) šaknies meristemoje esančių mikrotubulių mitozinė struktūra.Mikrotubulai buvo vizualizuoti naudojant imunohistocheminį dažymą.Mitozinės struktūros, įskaitant profazės zonas, verpstes ir fragmoplastus, buvo skaičiuojamos iš konfokalinių vaizdų.Rodyklės rodo mitozines mikrotubulų struktūras.Žvaigždutės rodo reikšmingus skirtumus, susijusius su apgaulingu gydymu (t testas, p< 0,05).n>9. Mastelio juosta = 50 µm.
Nors Ursa gali sutrikdyti mikrovamzdelių funkciją, tikimasi, kad jos veikimo mechanizmas skirsis nuo įprastų mikrovamzdelius depolimerizuojančių medžiagų.Pavyzdžiui, didesnės koncentracijos mikrotubulius depolimerizuojančių medžiagų, tokių kaip dizopiramidas ir orizalinas, sukelia anizotropinį epidermio ląstelių išsiplėtimą, o KAND 11 to nedaro.Be to, kartu taikant KAND 11 ir dizopiramidą, buvo pastebėtas kartu dizopiramido sukeltas šaknų augimo atsakas ir buvo pastebėtas KAND 11 sukeltas augimo slopinimas (S4 pav.).Taip pat išanalizavome padidėjusio jautrumo dizopiramido 1-1 (phs1-1) mutanto atsaką į KAND 11. phs1-1 turi nekanoninę tubulino kinazės taškinę mutaciją ir, gydant dizopiramidu, sukuria trumpesnes šaknis9,20.phs1-1 mutantų sodinukai, auginami agaro terpėje, kurioje yra KAND 11, turėjo trumpesnes šaknis, panašias į išaugintas ant disopiramidės (S5 pav.).
Be to, KAND 11 apdorotų sodinukų šaknies meristemoje stebėjome mitozines mikrovamzdelių struktūras, tokias kaip profazės zonos, verpstės ir fragmoplastai. Remiantis CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS stebėjimais, reikšmingai sumažėjo pastebėtas mitozinių mikrotubulių skaičius (.6c pav.).
Norėdami apibūdinti KAND 11 citotoksiškumą tarpląstelinėje skiriamojoje geboje, tabako BY-2 suspensijos ląsteles apdorojome KAND 11 ir stebėjome jų atsaką.Pirmiausia KAND 11 pridėjome prie BY-2 ląstelių, ekspresuojančių TagRFP-TUA6, kurios fluorescenciškai žymi mikrotubules, kad įvertintume KAND 11 poveikį žievės mikrotubulams.Žievės mikrotubulų tankis buvo įvertintas naudojant vaizdo analizę, kuri kiekybiškai įvertino citoskeleto pikselių procentą tarp citoplazminių pikselių.Tyrimo rezultatai parodė, kad po 1 valandos apdorojimo 50 μM arba 100 μM KAND 11 tankis žymiai sumažėjo iki atitinkamai 0,94 ± 0,74 % arba 0,23 ± 0,28 %, o ląstelių, apdorotų DMSO, tankis siekė 1,61 ± 0,61 % (7a pav.).Šie rezultatai atitinka Arabidopsis pastebėjimą, kad gydymas KAND 11 skatina žievės mikrotubulių depolimerizaciją (6b pav.).Taip pat ištyrėme BY-2 liniją su GFP-ABD pažymėtomis aktino gijomis po apdorojimo ta pačia KAND 11 koncentracija ir pastebėjome, kad gydymas KAND 11 sutrikdė aktino gijas.Gydymas 50 μM arba 100 μM KAND 11 1 valandą reikšmingai sumažino aktino gijų tankį iki atitinkamai 1,20 ± 0,62 % arba 0,61 ± 0,26 %, o tankis DMSO apdorotose ląstelėse buvo 1,69 ± 0,51 % (F ig 0,51 %).7b).Šie rezultatai skiriasi nuo propizamido, kuris neturi įtakos aktino gijų, ir latrunkulino B, aktino depolimerizatoriaus, kuris neturi įtakos mikrotubulėms, poveikiui (SI S6 pav.).Be to, gydymas kumamonamidu 1, kumamonamido rūgštimi 6 arba KAND 11 neturėjo įtakos mikrotubulams HeLa ląstelėse (SI S7 pav.).Taigi, manoma, kad KAND 11 veikimo mechanizmas skiriasi nuo žinomų citoskeletą ardančių medžiagų.Be to, mūsų mikroskopinis BY-2 ląstelių, apdorotų KAND 11, stebėjimas atskleidė ląstelių žūties pradžią gydymo KAND 11 metu ir parodė, kad Evans mėlyna spalva nudažytų negyvų ląstelių dalis po 30 minučių gydymo KAND 11 žymiai nepadidėjo, o tuo tarpu po 90 minučių gydymo 50 μM arba 100 μM KAND negyvų ląstelių skaičius padidėjo atitinkamai iki 43,7 % arba 80,1 % (7c pav.).Visi šie duomenys rodo, kad naujasis ursolio rūgšties darinys KAND 11 yra augalams specifinis citoskeleto inhibitorius, kurio veikimo mechanizmas anksčiau nežinomas.
KAND veikia žievės mikrotubules, aktino gijas ir tabako BY-2 ląstelių gyvybingumą.a ) Žievės mikrotubulių vizualizavimas BY-2 ląstelėse, esant TagRFP-TUA6.BY-2 ląstelės, apdorotos KAND 11 (50 μM arba 100 μM) arba DMSO, buvo tiriamos konfokaline mikroskopija.Žievės mikrotubulų tankis buvo apskaičiuotas iš 25 nepriklausomų ląstelių mikrografijų.Raidės rodo reikšmingus skirtumus (Tukey HSD testas, p< 0,05).Mastelio juosta = 10 µm.( b ) Žievės aktino gijos BY-2 ląstelėse, vizualizuotos esant GFP-ABD2.BY-2 ląstelės, apdorotos KAND 11 (50 μM arba 100 μM) arba DMSO, buvo tiriamos konfokaline mikroskopija.Žievės aktino gijų tankis buvo apskaičiuotas iš 25 nepriklausomų ląstelių mikrografijų.Raidės rodo reikšmingus skirtumus (Tukey HSD testas, p< 0,05).Mastelio juosta = 10 µm.c) Negyvų BY-2 ląstelių stebėjimas dažant Evans mėlynąja spalva.BY-2 ląstelės, apdorotos KAND 11 (50 μM arba 100 μM) arba DMSO, buvo tiriamos šviesaus lauko mikroskopu.n=3.Mastelio juosta = 100 µm.
Naujų natūralių produktų atradimas ir pritaikymas padarė didelę pažangą įvairiuose žmogaus gyvenimo aspektuose, įskaitant mediciną ir žemės ūkį.Buvo atlikti istoriniai tyrimai, siekiant gauti naudingų junginių iš gamtos išteklių.Visų pirma žinoma, kad aktinomicetai yra naudingi kaip antiparazitiniai antibiotikai nematodams dėl jų gebėjimo gaminti įvairius antrinius metabolitus, tokius kaip avermektinas, švino ivermektino ir bleomicino junginys bei jo dariniai, medicinoje naudojami kaip priešvėžinis agentas21,22.Taip pat iš aktinomicetų buvo aptikta įvairių herbicidinių junginių, kai kurie iš jų jau naudojami komerciniais tikslais1,23.Todėl aktinomicetų metabolitų analizė, norint išskirti natūralius produktus su norimu biologiniu aktyvumu, laikoma veiksminga strategija.Šiame tyrime mes atradome naują S. werraensis junginį – kumamonamidą ir sėkmingai jį susintetinome.Ursono rūgštis yra sintetinis urbenamido ir jo darinių tarpinis produktas.Jis gali sukelti būdingą šaknų garbanotumą, vidutinį ar stiprų herbicidinį aktyvumą ir tiesiogiai ar netiesiogiai pažeisti augalų mikrovamzdelius.Tačiau urmotono rūgšties veikimo mechanizmas gali skirtis nuo esamų mikrotubulių inhibitorių, nes KAND 11 taip pat ardo aktino gijas ir sukelia ląstelių mirtį, o tai rodo reguliavimo mechanizmą, kuriuo urmotono rūgštis ir jos dariniai veikia daugybę citoskeleto struktūrų..
Tolesnis išsamus urbenono rūgšties apibūdinimas padės geriau suprasti urbenono rūgšties veikimo mechanizmą.Visų pirma, kitas tikslas – įvertinti ursono rūgšties gebėjimą jungtis prie redukuotų mikrovamzdelių, siekiant nustatyti, ar ursono rūgštis ir jos dariniai tiesiogiai veikia mikrovamzdelius ir juos depolimerizuoja, ar dėl jų veikimo mikrovamzdeliai destabilizuojasi.Be to, tuo atveju, kai mikrovamzdeliai nėra tiesioginis taikinys, ursono rūgšties veikimo vietos ir molekulinių taikinių nustatymas augalų ląstelėse padės geriau suprasti susijusių junginių savybes ir galimus būdus pagerinti herbicidinį aktyvumą.Mūsų bioaktyvumo tyrimas atskleidė unikalų ursono rūgšties citotoksinį poveikį augalų, tokių kaip Arabidopsis thaliana, tabakas ir kepenys, augimui, tuo tarpu nei E. coli, nei HeLa ląstelės nebuvo paveiktos.Mažas toksiškumas gyvūnų ląstelėms arba jo visai nėra, yra ursono rūgšties darinių pranašumas, jei jie sukurti kaip herbicidai, skirti naudoti atviruose žemės ūkio laukuose.Iš tiesų, kadangi mikrotubulai yra įprastos eukariotų struktūros, jų selektyvus slopinimas augaluose yra pagrindinis herbicidų reikalavimas.Pavyzdžiui, propizamidas, mikrotubulius depolimerizuojantis agentas, kuris tiesiogiai jungiasi su tubulinu ir slopina polimerizaciją, yra naudojamas kaip herbicidas dėl mažo toksiškumo gyvūnų ląstelėms24.Priešingai nei dizopiramidas, giminingi benzamidai turi skirtingą tikslinį specifiškumą.Be augalų mikrovamzdelių, RH-4032 arba benzoksamidas taip pat slopina atitinkamai gyvūnų ląstelių arba oomicetų mikrovamzdelius, o zalilamidas naudojamas kaip fungicidas dėl mažo fitotoksiškumo25,26,27.Naujai atrastas lokys ir jo dariniai turi selektyvų citotoksiškumą augalams, tačiau verta paminėti, kad tolesni pakeitimai gali pakeisti jų tikslinį specifiškumą, o tai gali suteikti papildomų darinių, skirtų patogeninių grybų ar oomicetų kontrolei.
Unikalios urbenono rūgšties ir jos darinių savybės yra naudingos kuriant juos kaip herbicidus ir naudojant kaip tyrimo priemones.Citoskeleto svarba kontroliuojant augalų ląstelių formą yra plačiai pripažinta.Ankstesni tyrimai parodė, kad augalai sukūrė sudėtingus žievės mikrotubulų organizavimo mechanizmus, kontroliuodami mikrotubulų dinamiką, kad būtų galima tinkamai kontroliuoti morfogenezę.Buvo nustatyta daug molekulių, atsakingų už mikrotubulų aktyvumo reguliavimą, o susiję tyrimai vis dar vyksta 3, 4, 28.Mūsų dabartinis supratimas apie mikrotubulų dinamiką augalų ląstelėse nevisiškai paaiškina žievės mikrotubulų organizavimo mechanizmus.Pavyzdžiui, nors ir dizopiramidas, ir orizalinas gali depolimerizuoti mikrovamzdelius, dizopiramidas sukelia stiprų šaknų iškraipymą, o orizalinas veikia gana švelniai.Be to, tubulino, kuris stabilizuoja mikrovamzdelius, mutacijos taip pat sukelia šaknų sukimąsi į dešinę, o paklitakselis, kuris taip pat stabilizuoja mikrotubulių dinamiką, nesukelia.Todėl ursolio rūgšties molekulinių taikinių tyrimas ir nustatymas turėtų suteikti naujų įžvalgų apie augalų žievės mikrotubulių reguliavimą.Taip pat būsimi cheminių medžiagų, kurios veiksmingai skatina iškreiptą augimą, pvz., dizopiramidą, ir mažiau veiksmingų cheminių medžiagų, tokių kaip orizalinas arba kumamotorinė rūgštis, palyginimai suteiks užuominų apie iškreiptą augimą.
Kita vertus, su gynyba susiję citoskeleto pertvarkymai yra dar viena galimybė paaiškinti ursono rūgšties citotoksiškumą.Patogeno užkrėtimas arba eliciatoriaus patekimas į augalų ląsteles kartais sukelia citoskeleto sunaikinimą ir vėlesnę ląstelių mirtį29.Pavyzdžiui, buvo pranešta, kad iš oomicetų gautas kriptoksantinas suardo mikrovamzdelius ir aktino gijas prieš tabako ląstelių mirtį, panašiai kaip tai atsitinka gydant KAND 30, 31.Apsaugos ir ursono rūgšties sukeltų ląstelių atsakų panašumai leido daryti prielaidą, kad jie sukelia bendrus ląstelių procesus, nors akivaizdus greitesnis ir stipresnis ursono rūgšties poveikis nei kriptoksantinas.Tačiau tyrimai parodė, kad aktino gijų sutrikimas skatina spontanišką ląstelių mirtį, kurią ne visada lydi mikrovamzdelių sutrikimas29.Be to, dar reikia išsiaiškinti, ar patogenas ar eliciatorius sukelia iškreiptą šaknų augimą, kaip tai daro ursono rūgšties dariniai.Taigi molekulinės žinios, jungiančios gynybos reakcijas ir citoskeletą, yra patraukli problema, kurią reikia spręsti.Išnaudojant mažos molekulinės masės junginius, susijusius su ursono rūgštimi, taip pat įvairiais skirtingo stiprumo dariniais, jie gali suteikti galimybę nukreipti į nežinomus ląstelių mechanizmus.
Apibendrinant, naujų junginių, moduliuojančių mikrotubulų dinamiką, atradimas ir taikymas suteiks galingų metodų, kaip išspręsti sudėtingus molekulinius mechanizmus, kuriais grindžiamas augalų ląstelių formos nustatymas.Šiame kontekste neseniai sukurtas junginys urmotoninė rūgštis, kuri veikia mikrotubules ir aktino gijas bei sukelia ląstelių mirtį, gali suteikti galimybę iššifruoti ryšį tarp mikrotubulų kontrolės ir šių kitų mechanizmų.Taigi cheminė ir biologinė analizė naudojant urbenono rūgštį padės mums suprasti molekulinius reguliavimo mechanizmus, kurie kontroliuoja augalų citoskeletą.
Inokuliuokite S. werraensis MK493-CF1 į 500 ml talpos Erlenmeyer kolbą, kurioje yra 110 ml sėklų terpės, kurią sudaro 2 % (m/t) galaktozės, 2 % (m/t) esencijos pastos, 1 % (m/t) Bacto kompozicijos .-soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (m/v) kukurūzų ekstrakto (KOGOSTCH Co., Ltd., Japonija), 0,2% (m/v) (NH4)2SO4 ir 0,2% CaCO3 dejonizuotame vandenyje.(pH 7,4 prieš sterilizaciją).Sėklų kultūros 2 dienas buvo inkubuojamos sukamajame kratytuve (180 aps./min.) 27 °C temperatūroje.Gamybos auginimas kietosios būsenos fermentacijos būdu.Sėklų kultūra (7 ml) buvo perkelta į 500 ml K-1 kolbą, kurioje yra 40 g gamybos terpės, kurią sudaro 15 g presuotų miežių (MUSO Co., Ltd., Japonija) ir 25 g dejonizuoto vandens (pH nereguliuotas). prieš sterilizaciją).).Fermentacija buvo vykdoma 30 ° C temperatūroje tamsoje 14 dienų.Fermentacijos medžiaga buvo ekstrahuota 40 ml/buteliuke EtOH ir centrifuguojama (1500 g, 4°C, 10 min.).Kultūros supernatantas (60 ml) ekstrahuotas 10% MeOH/EtOAc mišiniu.Organinis sluoksnis išgarinamas sumažintame slėgyje, gaunant likutį (59,5 mg), kuri buvo atlikta HPLC su gradiento eliuavimu (0–10 min.: 90%) atvirkštinės fazės kolonėlėje (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × ilgis 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 min.: 90 % H2O/CH3CN iki 70 % H2O/CH3CN (gradientas), 35–45 min.: 90 % H2O/EtOH, 45–155 min.: 90 % H2O /EtOH iki 100% EtOH (gradientas (gradientas), 155–200 min.: 100% EtOH) esant 1,5 ml/min srauto greičiui, kumamonamidas (1, 36,0 mg) buvo išskirtas kaip balti amorfiniai milteliai.
Kumamotoamidas (1);1H-BMR (500 MHz, CDC13) 8 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz, 1H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1H).), 4,08 (s, 3H);13C-BMR (125 MHz, CDCl3) 8 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ apskaičiuota vertė: 141,0659, išmatuota vertė: 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm.
Kolumbijos sėklos (Col-0) buvo gautos iš Arabidopsis biologinių išteklių centro (ABRC) su leidimu naudoti moksliniams tyrimams.Col-0 sėklos buvo dauginamos ir prižiūrimos mūsų laboratorinėmis sąlygomis ir naudojamos kaip laukinio tipo Arabidopsis augalai.Arabidopsis sėklos buvo sterilizuotos paviršiuje ir kultivuojamos pusės stiprumo Murashige ir Skoog terpėje, kurioje yra 2% sacharozės (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (m/v) 2-(4-morfolino)etansulfoninės rūgšties (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical). ).) ir 1,5 % agaro (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, esant 23 °C ir pastoviai šviesai.phs1-1 mutanto sėklas pateikė T. Hashimoto (Nara mokslo ir technologijų institutas).
SR-1 padermės sėklas pateikė T. Hashimoto (Nara mokslo ir technologijų institutas) ir naudojo kaip laukinio tipo tabako augalus.Tabako sėklos buvo sterilizuojamos paviršiumi ir tris naktis mirkomos steriliame vandenyje, kad būtų skatinamas daigumas, tada dedamos į pusės stiprumo tirpalą, kuriame yra 2% sacharozės, 0,05% (m/v) MES ir 0,8% gelano dervos (Fujifilm Wako Pure Chemical). Murashige.ir Skoog terpė), kurios pH yra 5,7, ir inkubuojama 23 °C temperatūroje nuolatinėje šviesoje.
Padermę Tak-1 pateikė T. Kohchi (Kioto universitetas) ir ji buvo naudojama kaip standartinis eksperimentinis vienetas tiriant kepenėles.Gemma buvo gauta iš sterilizuotų kultivuojamų augalų ir po to padengta Gamborg B5 terpėje (Fujifilm Wako Pure Chemical), kurioje yra 1% sacharozės ir 0,3% gelano dervos, ir inkubuojama 23 ° C temperatūroje nuolatinėje šviesoje.
Tabako BY-2 ląsteles (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) pateikė S. Hasezawa (Tokijo universitetas).BY-2 ląstelės buvo skiedžiamos 95 kartus modifikuotoje Linsmeier ir Skoog terpėje ir kas savaitę papildoma 2,4-dichlorfenoksiacto rūgštimi32.Ląstelių suspensija buvo maišoma sukamajame kratytuve 130 aps./min., 27 °C temperatūroje, tamsoje.Nuplaukite ląsteles 10 kartų didesniu tūriu šviežios terpės ir resuspenduokite toje pačioje terpėje.BY-2 transgeninės ląstelių linijos, stabiliai ekspresuojančios mikrotubulų žymeklį TagRFP-TUA6 arba aktino gijų žymenį GFP-ABD2 po žiedinių kopūstų mozaikos viruso 35S promotoriumi, buvo sukurtos taip, kaip aprašyta 33, 34, 35.Šios ląstelių linijos gali būti palaikomos ir sinchronizuojamos naudojant procedūras, panašias į tas, kurios buvo naudojamos pradinei BY-2 ląstelių linijai.
HeLa ląstelės buvo kultivuojamos Dulbecco modifikuotoje Eagle terpėje (DMEM) (Life Technologies), papildytoje 10% galvijų vaisiaus serumu, 1,2 U/ml penicilino ir 1,2 μg/ml streptomicino 37°C inkubatoriuje su 5% CO2.
Visi šiame rankraštyje aprašyti eksperimentai buvo atlikti pagal Japonijos biologinės saugos taisykles ir gaires.
Junginiai buvo ištirpinti dimetilsulfokside (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) kaip pradiniai tirpalai ir praskiesti MS terpėje Arabidopsis ir tabakui arba Gamborg B5 terpėje kepenų žolėms.Šaknų augimo slopinimo tyrimui daugiau nei 10 sėklų vienoje plokštelėje buvo pasėta į agaro terpę, kurioje yra nurodytų junginių arba DMSO.Sėklos buvo inkubuojamos augimo kameroje 7 dienas.Daigai nufotografuoti, išmatuotas šaknų ilgis.Arabidopsis daigumo tyrimui 48 sėklos vienoje plokštelėje buvo pasėtos agaro terpėje, kurioje yra 200 μM junginio arba DMSO.Arabidopsis sėklos buvo auginamos augimo kameroje, o sudygusių daigų skaičius buvo skaičiuojamas praėjus 7 dienoms po sudygimo (dag).Tabako daigumo tyrimui 24 sėklos vienoje plokštelėje buvo pasėtos agaro terpėje, kurioje yra 200 μM KAND arba DMSO.Tabako sėklos buvo auginamos augimo kameroje, o sudygusių daigų skaičius skaičiuojamas po 14 dienų.Kepenėlių augimo slopinimo tyrimui 9 embrionai iš kiekvienos plokštelės buvo dedami į agaro terpę, kurioje buvo nurodytos KAND arba DMSO koncentracijos, ir inkubuojami augimo kameroje 14 dienų.
Naudokite sodinukus, nudažytus 5 mg/ml propidžio jodidu (PI), kad pavaizduotų šaknų meristemų organizaciją.PI signalai buvo stebimi fluorescencine mikroskopija, naudojant TCS SPE konfokalinį lazerinį skenavimo mikroskopą (Leica Microsystems).
Histocheminis šaknų dažymas β-gliukuronidaze (GUS) buvo atliktas pagal Malami ir Benfey aprašytą protokolą36.Daigai buvo fiksuoti 90% acetone per naktį, 1 valandą dažomi 0, 5 mg / ml 5-brom-4-chlor-3-indolil-β-d-gliukurono rūgštimi GUS buferyje ir dedami į hidratuotą chloraldehido tirpalą.(8 g chloralio hidrato, 2 ml vandens ir 1 ml glicerolio) ir stebima diferencinio interferencinio kontrasto mikroskopu, naudojant Axio Imager M1 mikroskopą (Carl Zeiss).
Šaknies kampai buvo matuojami 7 dienų amžiaus sodinukams, auginamiems vertikaliai išdėstytose lėkštelėse.Išmatuokite šaknies kampą nuo gravitacijos vektoriaus krypties, kaip aprašyta 6 veiksme.
Žievės mikrotubulių išsidėstymas buvo stebimas taip, kaip aprašyta, su nedideliais protokolo pakeitimais37.Antikūnas prieš β-tubuliną (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) ir Alexa Fluor 488 konjuguotas anti-pelės IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) buvo naudojami kaip pirminiai ir antriniai antikūnai praskiedus 1:1000 ir 1:100, atitinkamai.Fluorescenciniai vaizdai buvo gauti naudojant TCS SPE konfokalinį lazerinį skenavimo mikroskopą (Leica Microsystems).Įsigykite Z-stack vaizdus ir kurkite didžiausio intensyvumo projekcijas pagal gamintojo instrukcijas.
HeLa ląstelių proliferacijos tyrimas buvo atliktas naudojant Cell Counting Kit 8 (Dojindo) pagal gamintojo instrukcijas.
E. coli DH5α augimas buvo analizuojamas išmatuojant ląstelių tankį kultūroje, naudojant spektrofotometrą esant 600 nm (OD600).
Citoskeleto struktūra transgeninėse BY-2 ląstelėse buvo stebima naudojant fluorescencinį mikroskopą su CSU-X1 konfokaliniu skenavimo įrenginiu (Yokogawa) ir sCMOS kamera (Zyla, Andor Technology).Citoskeleto tankis buvo įvertintas vaizdų analize, kuri kiekybiškai įvertino citoskeleto pikselių procentą tarp citoplazminių pikselių konfokaliniuose vaizduose naudojant ImageJ programinę įrangą, kaip aprašyta 38, 39.
Norint nustatyti ląstelių mirtį BY-2 ląstelėse, ląstelių suspensijos alikvotinė dalis buvo inkubuojama su 0, 05% Evans mėlyna 10 minučių kambario temperatūroje.Selektyvus Evanso mėlynas negyvų ląstelių dažymas priklauso nuo dažų išspaudimo iš gyvybingų ląstelių nepažeista plazmos membrana40.Dažytos ląstelės buvo stebimos naudojant šviesaus lauko mikroskopą (BX53, Olympus).
HeLa ląstelės buvo auginamos DMEM, papildytu 10% FBS, drėgname inkubatoriuje 37 ° C temperatūroje ir 5% CO2.Ląstelės buvo apdorotos 100 μM KAND 11, kumamonamo rūgštimi 6, kumamonamidu 1, 100 ng/ml kolcemidu (Gibco) arba 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) 6 valandas 37 °C temperatūroje.Ląstelės buvo fiksuotos MetOH 10 minučių, o po to 5 minutes acetatu kambario temperatūroje.Fiksuotos ląstelės buvo inkubuojamos su β-tubulino pirminiu antikūnu (1D4A4, Proteintech: 66240-1), praskiestu 0, 5% BSA / PBS 2 valandas, 3 kartus plaunamos TBST ir po to inkubuojamos su Alexa Fluor ožkų antikūnu.488 1 valanda.– Pelės IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) ir 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-fenilindolio (DAPI), praskiesto 0,5 % BSA/PBS.Tris kartus nuplovus TBST, nudažytos ląstelės buvo stebimos Nikon Eclipse Ti-E apverstu mikroskopu.Vaizdai buvo užfiksuoti aušinama Hamamatsu ORCA-R2 CCD kamera naudojant MetaMorph programinę įrangą (Molecular Devices).
Paskelbimo laikas: 2024-06-17