Dėkojame, kad apsilankėte Nature.com. Jūsų naudojama naršyklės versija turi ribotą CSS palaikymą. Norėdami gauti geriausius rezultatus, rekomenduojame naudoti naujesnę naršyklės versiją (arba išjungti suderinamumo režimą „Internet Explorer“). Tuo tarpu, siekdami užtikrinti nuolatinį palaikymą, svetainę rodome be stiliaus ar „JavaScript“.
Natūralių produktų atradimas ir naudingas naudojimas gali padėti pagerinti žmonių gyvenimą. Augalų augimą slopinančios cheminės medžiagos plačiai naudojamos kaip herbicidai piktžolėms kontroliuoti. Dėl poreikio naudoti įvairių tipų herbicidus, reikia nustatyti junginius, turinčius naujus veikimo mechanizmus. Šiame tyrime iš Streptomyces werraensis MK493-CF1 atradome naują N-alkoksipirolo junginį – kumamonamidą – ir nustatėme visą sintezės procesą. Atlikdami biologinio aktyvumo tyrimus, atradome, kad urs-monoamo rūgštis yra sintetinis urs-monoamido tarpinis produktas ir potencialus...augalų augimo inhibitoriusBe to, sukūrėme įvairių urbenono rūgšties darinių, įskaitant urbeniloksi darinį (UDA), kuris pasižymi dideliu herbicidiniu aktyvumu, neigiamai nepaveikdamas HeLa ląstelių augimo. Taip pat nustatėme, kad urmotono rūgšties dariniai ardo augalų mikrovamzdelius; be to, KAND veikia aktino filamentus ir sukelia ląstelių žūtį; šis daugialypis poveikis skiriasi nuo žinomų mikrovamzdelių inhibitorių poveikio ir rodo naują ursono rūgšties veikimo mechanizmą, kuris yra svarbus pranašumas kuriant naujus herbicidus.
Naudingų natūralių produktų ir jų darinių atradimas ir praktinis pritaikymas yra priemonė gerinti žmonių gyvenimo kokybę. Mikroorganizmų, augalų ir vabzdžių gaminami antriniai metabolitai lėmė didelę medicinos ir žemės ūkio pažangą. Iš natūralių produktų buvo sukurta daug antibiotikų ir vaistų nuo leukemijos. Be to, įvairių rūšiųpesticidaiIš šių natūralių produktų išgaunami fungicidai ir herbicidai, skirti naudoti žemės ūkyje. Visų pirma, piktžolių kontrolės herbicidai yra svarbios priemonės didinant pasėlių derlių šiuolaikiniame žemės ūkyje, o įvairių tipų junginiai jau naudojami komerciniais tikslais. Keletas augalų ląstelinių procesų, tokių kaip fotosintezė, aminorūgščių metabolizmas, ląstelių sienelių sintezė, mitozės reguliavimas, fitohormonų signalizacija arba baltymų sintezė, laikomi tipiškais herbicidų taikiniais. Junginiai, slopinantys mikrovamzdelių funkciją, yra įprasta herbicidų klasė, kuri veikia augalų augimą paveikdama mitozės reguliavimą2.
Mikrovamzdeliai yra citoskeleto komponentai ir yra plačiai konservatyvūs eukariotinėse ląstelėse. Tubulino heterodimerą sudaro α-tubulinas ir β-tubulinas, sudarantys linijinius mikrovamzdelių protofilamentus, o 13 protofilamentų sudaro cilindrinę struktūrą. Mikrovamzdeliai augalų ląstelėse atlieka daug vaidmenų, įskaitant ląstelės formos nustatymą, ląstelių dalijimąsi ir tarpląstelinį pernašą3,4. Augalų ląstelėse yra mikrovamzdelių po tarpfazine plazmine membrana, ir manoma, kad šie vadinamieji žievės mikrovamzdeliai kontroliuoja celiuliozės mikrofibrilių organizaciją reguliuodami celiuliozės sintazės kompleksus4,5. Šaknų epidermio ląstelių žievės mikrovamzdeliai, esantys šaknies viršūnės greito pailgėjimo zonoje, yra išsidėstę šonuose, o celiuliozės mikropluoštai seka šiuos mikrovamzdelius ir riboja ląstelių plėtimosi kryptį, taip skatindami anizotropinį ląstelių pailgėjimą. Todėl mikrovamzdelių funkcija yra glaudžiai susijusi su augalo morfologija. Aminorūgščių pakeitimai genuose, koduojančiuose tubuliną, sukelia žievės mikrovamzdelių masyvų iškreiptumą ir kairįjį arba dešinįjį augimą Arabidopsis augale 6,7. Panašiai, su mikrovamzdeliais susijusių baltymų, reguliuojančių mikrovamzdelių dinamiką, mutacijos taip pat gali sukelti iškreiptą šaknų augimą8,9,10,11,12,13. Be to, apdorojimas mikrovamzdelius ardančiais herbicidais, tokiais kaip disopiramidas, dar žinomas kaip pretilachloras, taip pat sukelia kairiosios pusės įstrižinių šaknų augimą14. Šie duomenys rodo, kad tikslus mikrovamzdelių funkcijos reguliavimas yra labai svarbus nustatant augalo augimo kryptį.
Atrasta įvairių tipų mikrovamzdelių inhibitorių, ir šie vaistai reikšmingai prisidėjo prie citoskeleto tyrimų, taip pat prie žemės ūkio ir medicinos2. Visų pirma, orizalinas, dinitroanilino junginiai, dizopiramidas, benzamido giminingi junginiai ir jų analogai gali slopinti mikrovamzdelių funkciją ir taip slopinti augalų augimą. Todėl jie plačiai naudojami kaip herbicidai. Tačiau kadangi mikrovamzdeliai yra svarbus augalų ir gyvūnų ląstelių komponentas, dauguma mikrovamzdelių inhibitorių yra citotoksiniai abiejų tipų ląstelėms. Todėl, nepaisant pripažinto jų naudingumo kaip herbicidų, praktiniais tikslais naudojamas ribotas skaičius antimikrovamzdelių agentų.
Streptomyces yra Streptomyces šeimos gentis, kuriai priklauso aerobinės, gramteigiamos, filamentinės bakterijos ir kuri yra plačiai žinoma dėl savo gebėjimo gaminti platų antrinių metabolitų spektrą. Todėl ji laikoma vienu svarbiausių naujų biologiškai aktyvių natūralių produktų šaltinių. Šiame tyrime atradome naują junginį, vadinamą kumamonamidu, kuris buvo išskirtas iš Streptomyces werraensis MK493-CF1 ir S. werraensis ISP 5486. Naudojant spektrinę analizę ir pilną spektrinę analizę, buvo apibūdinta kumamonamido struktūra ir nustatytas jo unikalus N-alkoksipirolo skeletas. Nustatyta, kad ursmono rūgštis, sintetinis ursmonoamido ir jos darinių tarpinis produktas, slopina populiaraus modelinio augalo Arabidopsis thaliana augimą ir dygimą. Struktūros ir aktyvumo ryšio tyrime nustatėme, kad junginys, kurio C9 modifikuotas į ursono rūgštį, vadinamas ursono rūgšties noniloksi dariniu (KAND), žymiai sustiprina slopinamąjį poveikį augimui ir dygimui. Pažymėtina, kad naujai atrastas augalų augimo inhibitorius taip pat paveikė tabako ir kepenų žolės augimą ir nebuvo citotoksinis bakterijoms ar HeLa ląstelėms. Be to, kai kurie urmotono rūgšties dariniai sukelia iškreiptą šaknų fenotipą, o tai reiškia, kad šie dariniai tiesiogiai arba netiesiogiai veikia mikrovamzdelius. Remiantis šia idėja, mūsų stebėjimai, gauti iš imunohistochemiškai arba fluorescenciniais baltymais žymėtų mikrovamzdelių, rodo, kad KAND apdorojimas depolimerizuoja mikrovamzdelius. Be to, apdorojimas kumamotono rūgšties dariniais sutrikdė aktino mikrofilamentus. Taigi, atradome naują augalų augimo inhibitorių, kurio unikalus veikimo mechanizmas apima citoskeleto sunaikinimą.
MK493-CF1 padermė buvo išskirta iš dirvožemio Šinagavos rajone, Tokijuje. MK493-CF1 padermė suformavo gerai išsišakojusią stromos micelį. Buvo nustatyta dalinė 16S ribosominės RNR geno seka (1422 bp). Ši padermė labai panaši į S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: tipinė padermė, 99,93 %). Remiantis šiuo rezultatu, nustatyta, kad ši padermė yra glaudžiai susijusi su S. werraensis tipine paderme. Todėl šią padermę preliminariai pavadinome S. werraensis MK493-CF1. S. werraensis ISP 5486T taip pat gamina tuos pačius bioaktyvius junginius. Kadangi ankstyvųjų tyrimų apie natūralių produktų išgavimą iš šio mikroorganizmo buvo atlikta mažai, buvo atlikti tolesni cheminiai tyrimai. Po 14 dienų S. werraensis MK493-CF1 kultivavimo miežių terpėje kietosios fazės fermentacijos būdu 30 °C temperatūroje, terpė buvo ekstrahuota 50 % EtOH. 60 ml mėginio buvo išdžiovinta, gaunant 59,5 mg nevalyto ekstrakto. Nevalytas ekstraktas buvo chromatografuotas atvirkštinės fazės HPLC metodu, gaunant N-metoksi-1H-pirol-2-karboksamidą (1, vadinamą kumamonamidu, 36,0 mg). Bendras 1 kiekis sudaro maždaug 60 % nevalyto ekstrakto. Todėl nusprendėme išsamiai ištirti kumamotoamido 1 savybes.
Kumamonamidas 1 yra balti amorfiniai milteliai, o didelės skiriamosios gebos masių spektrometrija (HRESIMS) patvirtina C6H8N2O2 (1 pav.). Šio junginio C2-pakeistas pirolo fragmentas pasižymi δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH 1H BMR spektre: 4,5 Hz, H-5) ir δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), o 13C BMR spektras rodo keturių sp2 anglies atomų buvimą. Amido grupės buvimas C2 padėtyje buvo įvertintas HMBC koreliacijos metodu nuo C-3 protono iki amido karbonilo anglies, esant δC 161,1. Be to, 1H ir 13C BMR pikai ties δH 4,10 (3H, S) ir δC 68,3 rodo N-metoksi grupių buvimą molekulėje. Nors teisinga metoksi grupės padėtis dar nebuvo nustatyta naudojant spektroskopinę analizę, tokią kaip sustiprinta skirtuminė spektroskopija ir branduolinė Overhauzerio santrumpa (NOEDF), N-metoksi-1H-pirol-2-karboksamidas tapo pirmuoju junginiu kandidatu.
Siekiant nustatyti teisingą 1 struktūrą, buvo atlikta pilna sintezė (2a pav.). Komerciniu būdu prieinamo 2-aminopiridino 2 veikimas m-CPBA leido gauti atitinkamą N-oksidą 3 kiekybiniu išeiga. Po 2-aminoazidinimo 2, Abramovičiaus aprašyta ciklokondensacijos reakcija buvo atlikta benzene 90 °C temperatūroje, siekiant gauti norimą 1-hidroksi-1H-pirol-2-karbonitrilį 5 gramais. Greitis 60 % (du etapai). 15,16. Metilinus ir hidrolizavus 4, gauta 1-metoksi-1H-pirol-2-karboksirūgštis (vadinama „kumotono rūgštimi“, 6) geru išeiga (70 %, du etapai). Galiausiai, amidinimas per rūgšties chlorido tarpinį junginį 6, naudojant vandeninį amoniaką, davė Kumamoto amidą 1, kurio išeiga buvo 98 %. Visi susintetinto 1 spektriniai duomenys buvo panašūs į išskirto 1, todėl 1 struktūra buvo nustatyta;
Bendra urbenamido ir urbeninės rūgšties sintezė ir biologinio aktyvumo analizė. (a) Bendra Kumamoto amido sintezė. (b) Septynių dienų laukinio tipo Arabidopsis Columbia (Col) daigai buvo auginami Murashige ir Skoog (MS) lėkštelėse, kuriose buvo nurodytos kumamonamido 6 arba kumamonamido 1 koncentracijos. Mastelio juosta = 1 cm.
Pirmiausia įvertinome urbenamido ir jo tarpinių junginių biologinį aktyvumą, atsižvelgdami į jų gebėjimą moduliuoti augalų augimą. Į MS agaro terpę pridėjome įvairių koncentracijų ursmonamido 1 arba ursmono rūgšties 6 ir šioje terpėje kultivavome Arabidopsis thaliana daigus. Šie tyrimai parodė, kad didelės (500 μM) 6 koncentracijos slopino šaknų augimą (2b pav.). Toliau, pakeisdami 6 N1 padėtį, sukūrėme įvairius darinius ir atlikome su jais struktūros ir aktyvumo ryšio tyrimus (analogų sintezės procesas aprašytas papildomoje informacijoje (SI)). Arabidopsis daigai buvo auginami terpėje, kurioje buvo 50 μM ursono rūgšties darinių, ir buvo matuojamas šaknų ilgis, kaip parodyta paveikslėlyje. Kaip parodyta 3a, b ir S1 paveiksluose, kumao rūgštys turi skirtingo ilgio linijines alkoksido grandines (9, 10, 11, 12 ir 13) arba dideles alkoksido grandines (15, 16 ir 17) N1 padėtyje. Dariniai parodė reikšmingą šaknų augimo slopinimą. Be to, nustatėme, kad 200 μM 10, 11 arba 17 panaudojimas slopino dygimą (3c ir S2 pav.).
Kumamoto amido ir susijusių junginių struktūros ir aktyvumo ryšio tyrimas. (a) Analogų struktūra ir sintezės schema. (b) 7 dienų daigų, auginamų MS terpėje su 50 μM kumamonamido darinių arba be jų, šaknų ilgio kiekybinis įvertinimas. Žvaigždutės rodo reikšmingus skirtumus, palyginti su kontroliniu gydymu (t testas, p< 0,05). n>18. Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± SD. nt reiškia „neišbandyta“, nes daugiau nei 50 % sėklų nesudygo. (c) Kiekybinis apdorotų sėklų, inkubuotų 7 dienas MS terpėje su 200 μM kumamonamido ir susijusių junginių arba be jų, dygimo greičio įvertinimas. Žvaigždutės rodo reikšmingus skirtumus, palyginti su kontroliniu gydymu (chi kvadrato testas). n = 96.
Įdomu tai, kad pridėjus alkilo šonines grandines, ilgesnes nei C9, sumažėjo slopinamasis aktyvumas, o tai rodo, kad su kumamoto rūgštimi susijusiems junginiams biologiniam aktyvumui parodyti reikalingos tam tikro dydžio šoninės grandinės.
Kadangi struktūros ir aktyvumo ryšio analizė parodė, kad C9 buvo modifikuotas į ursono rūgštį, o ursono rūgšties noniloksi darinys (toliau – KAND 11) buvo veiksmingiausias augalų augimo inhibitorius, atlikome išsamesnį KAND 11 apibūdinimą. Arabidopsis apdorojimas 50 μM KAND 11 beveik visiškai užkirto kelią dygimui, o mažesnės KAND 11 koncentracijos (40, 30, 20 arba 10 μM) slopino šaknų augimą priklausomai nuo dozės (4a, b pav.). Norėdami patikrinti, ar KAND 11 veikia šaknų meristemų gyvybingumą, ištyrėme propidžio jodidu (PI) nudažytas šaknų meristemas ir išmatavome meristemų ploto dydį. Terpėje, kurioje yra 25 μM KAND-11, auginamų daigų meristemos dydis buvo 151,1 ± 32,5 μm, o kontrolinėje terpėje, kurioje yra DMSO, auginamų daigų meristemos dydis buvo 264,7 ± 30,8 μm (4c, d pav.), o tai rodo, kad KAND-11 atkuria ląstelių aktyvumą. Šaknų meristema. Tai atitinka tai, kad gydymas KAND 11 sumažino ląstelių dalijimosi žymens CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS signalo kiekį šaknų meristemoje (4e pav.)17. Šie rezultatai rodo, kad KAND 11 slopina šaknų augimą, mažindamas ląstelių proliferacijos aktyvumą.
Urbenono rūgšties darinių (urbeniloksi darinių) slopinamojo poveikio augimui analizė. (a) 7 dienų amžiaus laukinio tipo Col daigai, auginami MS lėkštelėse su nurodytomis KAND 11 koncentracijomis. Mastelio juosta = 1 cm. (b) Šaknų ilgio kiekybinis įvertinimas. Raidės rodo reikšmingus skirtumus (Tukey HSD testas, p< 0,05). n>16. Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± SD. (c) Propidžio jodidu dažytų laukinio tipo Col šaknų, išaugintų MS plokštelėse su 25 μM KAND 11 arba be jo, konfokalinė mikroskopija. Balti skliaustai žymi šaknies meristemą. Skalės juosta = 100 µm. (d) Šaknies meristemos dydžio kiekybinis įvertinimas (n = nuo 10 iki 11). Statistiniai skirtumai buvo nustatyti naudojant t-testą (p< 0,05). Stulpeliai rodo vidutinį meristemos dydį. (e) Šaknies meristemos, kurioje yra CDKB2 konstrukcija, diferencinės interferencinės kontrastinės (DIC) mikroskopija; 1pro: CDKB2; 1-GUS dažymas ir dažymas ant 5 dienų daigų, auginamų MS plokštelėse su 25 µM KAND tyrimu arba be jo.
KAND 11 fitotoksiškumas buvo toliau tiriamas naudojant kitą dviskiltį augalą – tabaką (Nicotiana tabacum) ir pagrindinį sausumos augalo modelinį organizmą – kepenėlę (Marchantia polymorpha). Kaip ir Arabidopsis atveju, tabako SR-1 daigai, auginami terpėje, kurioje yra 25 μM KAND 11, išaugino trumpesnes šaknis (5a pav.). Be to, 40 iš 48 sėklų sudygo ant lėkštelių, kuriose buvo 200 μM KAND 11, o visos 48 sėklos sudygo terpėje, kurioje buvo panaudota dirbtinė terpė, o tai rodo, kad didesnės KAND koncentracijos buvo reikšmingos (p< 0,05; chi kriterijus - kvadratas) slopino tabako dygimą. (5b pav.). Be to, KAND 11 koncentracija, slopinusi bakterijų augimą kepenų žolėse, buvo panaši į veiksmingą koncentraciją Arabidopsis (5c pav.). Šie rezultatai rodo, kad KAND 11 gali slopinti įvairių augalų augimą. Tada ištyrėme galimą su meškų monoamidu susijusių junginių citotoksiškumą kituose organizmuose, būtent žmogaus HeLa ląstelėse ir Escherichia coli DH5α padermėje, atitinkamai kaip aukštesniųjų gyvūnų ir bakterijų ląstelių atstovėse. Ląstelių proliferacijos tyrimų serijoje pastebėjome, kad kumamonamidas 1, kumamonamido rūgštis 6 ir KAND 11 neturėjo įtakos HeLa ar E. coli ląstelių augimui esant 100 μM koncentracijoms (5d, e pav.).
KAND 11 augimo slopinimas ne Arabidopsis organizmuose. (a) Dviejų savaičių amžiaus laukinio tipo SR-1 tabako daigai buvo auginami vertikaliai išdėstytose MS lėkštelėse, kuriose buvo 25 μM KAND 11. (b) Dviejų savaičių amžiaus laukinio tipo SR-1 tabako daigai buvo auginami horizontaliai išdėstytose MS lėkštelėse, kuriose buvo 200 μM KAND 11. (c) Dviejų savaičių amžiaus laukinio tipo Tak-1 kepenų žolės pumpurai, auginami Gamborg B5 lėkštelėse su nurodytomis KAND 11 koncentracijomis. Raudonos rodyklės rodo sporas, kurios nustojo augti per dviejų savaičių inkubacijos laikotarpį. (d) HeLa ląstelių proliferacijos tyrimas. Gyvybingų ląstelių skaičius buvo matuojamas fiksuotais laiko intervalais naudojant ląstelių skaičiavimo rinkinį 8 (Dojindo). Kaip kontrolė, HeLa ląstelės buvo apdorotos 5 μg/ml aktinomicino D (Act D), kuris slopina RNR polimerazės transkripciją ir sukelia ląstelių žūtį. Analizės buvo atliktos trimis egzemplioriais. (e) E. coli ląstelių proliferacijos tyrimas. E. coli augimas buvo analizuojamas matuojant OD600. Kontrolei ląstelės buvo apdorotos 50 μg/ml ampicilino (Amp), kuris slopina bakterijų ląstelių sienelių sintezę. Analizės buvo atliktos trimis egzemplioriais.
Norėdami iššifruoti uramidui artimų junginių sukelto citotoksiškumo veikimo mechanizmą, iš naujo išanalizavome urbeninės rūgšties darinius, pasižyminčius vidutiniu slopinamuoju poveikiu, kaip parodyta paveikslėlyje. Kaip parodyta 2b, 6a paveiksluose, daigai, auginami ant agaro lėkštelių, kuriose yra didelė (200 μM) urmotono rūgšties 6 koncentracija, išaugino trumpesnes ir į kairę išlenktas šaknis (θ = –23,7 ± 6,1), o kontrolinėje terpėje auginamų daigų šaknys buvo beveik tiesios (θ = –3,8 ± 7,1). Žinoma, kad šis būdingas įstrižas augimas yra žievės mikrovamzdelių disfunkcijos rezultatas14,18. Remiantis šiuo atradimu, mikrovamzdelius destabilizuojantys vaistai disopiramidas ir orizalinas mūsų augimo sąlygomis sukėlė panašų šaknų pasvirimą (2b, 6a pav.). Tuo pačiu metu išbandėme urmotono rūgšties darinius ir atrinkome kelis iš jų, kurie, esant tam tikroms koncentracijoms, sukėlė įstrižą šaknų augimą. 8, 9 ir 15 junginiai pakeitė šaknų augimo kryptį atitinkamai esant 75 μM, 50 μM ir 40 μM koncentracijoms, o tai rodo, kad šie junginiai gali veiksmingai destabilizuoti mikrovamzdelius (2b, 6a pav.). Taip pat išbandėme stipriausią ursolio rūgšties darinį KAND 11, esant mažesnei koncentracijai (15 µM), ir nustatėme, kad KAND 11 panaudojimas slopino šaknų augimą ir kad šaknų augimo kryptis buvo netolygi, nors jos linko pasvirti į kairę (C3 pav.). Kadangi didesnės mikrovamzdelius destabilizuojančių vaistų koncentracijos kartais slopina augalo augimą, o ne sukelia šaknų pasvirimą, vėliau įvertinome galimybę, kad KAND 11 veikia mikrovamzdelius, stebėdami žievės mikrovamzdelius šaknų epidermio ląstelėse. Imunohistochemija, naudojant anti-β-tubulino antikūnus daigų šaknų epidermio ląstelėse, apdorotose 25 μM KAND 11, parodė beveik visų žievės mikrovamzdelių išnykimą epidermio ląstelėse pailgėjimo zonoje (6b pav.). Šie rezultatai rodo, kad kumamotono rūgštis ir jos dariniai tiesiogiai arba netiesiogiai veikia mikrovamzdelius, juos sutrikdydami, ir kad šie junginiai yra nauji mikrovamzdelių inhibitoriai.
Ursono rūgštis ir jos dariniai keičia žievės mikrovamzdelius Arabidopsis thaliana augale. (a) Šaknų polinkio kampas, išmatuotas esant įvairiems urmotono rūgšties dariniams nurodytomis koncentracijomis. Taip pat buvo analizuojamas dviejų junginių, žinomų kaip mikrovamzdelių slopintojai: dizopiramido ir orizalino, poveikis. Įdėkle parodytas standartas, naudojamas šaknų augimo kampui matuoti. Žvaigždutės rodo reikšmingus skirtumus, palyginti su kontroliniu gydymu (t testas, p< 0,05). n>19. Mastelio juosta = 1 cm. (b) Žievės mikrovamzdeliai epidermio ląstelėse pailgėjimo zonoje. Laukinio tipo Arabidopsis Col šaknų, auginamų MS plokštelėse su 25 μM KAND 11 arba be jo, mikrovamzdeliai buvo vizualizuoti imunohistocheminiu dažymu naudojant β-tubulino pirminius antikūnus ir Alexa Fluor konjuguotus antrinius antikūnus. Mastelio juosta = 10 µm. (c) Mikrovamzdelių mitozinė struktūra šaknies meristemoje. Mikrovamzdeliai buvo vizualizuoti naudojant imunohistocheminį dažymą. Mitozinės struktūros, įskaitant profazės zonas, verpstes ir fragmoplastus, buvo suskaičiuotos iš konfokalinių vaizdų. Rodyklės rodo mitozinių mikrovamzdelių struktūras. Žvaigždutės rodo reikšmingus skirtumus, palyginti su kontroliniu gydymu (t testas, p< 0,05). n>9. Mastelio juosta = 50 µm.
Nors Ursa gali sutrikdyti mikrovamzdelių funkciją, tikimasi, kad jo veikimo mechanizmas skirsis nuo tipiškų mikrovamzdelių depolimerizuojančių agentų. Pavyzdžiui, didesnės mikrovamzdelių depolimerizuojančių agentų, tokių kaip disopiramidas ir orizalinas, koncentracijos sukelia epidermio ląstelių anizotropinę plėtrą, o KAND 11 – ne. Be to, kartu naudojant KAND 11 ir disopiramidą, buvo pastebėtas disopiramido sukeltas šaknų augimo atsakas ir KAND 11 sukeltas augimo slopinimas (S4 pav.). Taip pat išanalizavome padidėjusio jautrumo disopiramido 1-1 (phs1-1) mutanto atsaką į KAND 11. phs1-1 turi nekanoninę tubulino kinazės taškinę mutaciją ir, apdorojus disopiramidu, išaugina trumpesnes šaknis9,20. phs1-1 mutantų daigai, auginami agaro terpėje, kurioje yra KAND 11, turėjo trumpesnes šaknis, panašias į tas, kurios auginamos ant disopiramido (S5 pav.).
Be to, KAND 11 apdorotų daigų šaknų meristemoje stebėjome mitozinių mikrovamzdelių struktūras, tokias kaip profazės zonos, verpstės ir fragmoplastai. Sutampa su CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS stebėjimais, pastebėtas reikšmingas mitozinių mikrovamzdelių skaičiaus sumažėjimas (6c pav.).
Norėdami apibūdinti KAND 11 citotoksiškumą subląstelinėje skiriamojoje geboje, tabako BY-2 suspensijos ląsteles paveikėme KAND 11 ir stebėjome jų atsaką. Pirmiausia pridėjome KAND 11 prie BY-2 ląstelių, ekspresuojančių TagRFP-TUA6, kuris fluorescenciškai žymi mikrovamzdelius, kad įvertintume KAND 11 poveikį žievės mikrovamzdeliams. Žievinės mikrovamzdelių tankis buvo įvertintas naudojant vaizdų analizę, kuri kiekybiškai įvertino citoskeleto pikselių procentinę dalį tarp citoplazminių pikselių. Tyrimo rezultatai parodė, kad po 1 valandos apdorojimo 50 μM arba 100 μM KAND 11, tankis reikšmingai sumažėjo atitinkamai iki 0,94 ± 0,74 % arba 0,23 ± 0,28 %, o DMSO apdorotų ląstelių tankis siekė 1,61 ± 0,34 % (7a pav.). Šie rezultatai atitinka Arabidopsis pastebėjimą, kad apdorojimas KAND 11 sukelia žievės mikrovamzdelių depolimerizaciją (6b pav.). Taip pat ištyrėme BY-2 liniją su GFP-ABD žymėtais aktino filamentais po apdorojimo ta pačia KAND 11 koncentracija ir pastebėjome, kad apdorojimas KAND 11 sutrikdė aktino filamentus. Apdorojimas 50 μM arba 100 μM KAND 11 1 valandą reikšmingai sumažino aktino filamentų tankį atitinkamai iki 1,20 ± 0,62 % arba 0,61 ± 0,26 %, o DMSO apdorotose ląstelėse tankis buvo 1,69 ± 0,51 % (2 pav.). 7b). Šie rezultatai prieštarauja propizamido, kuris neveikia aktino filamentų, ir latrunkulino B, aktino depolimerizatoriaus, kuris neveikia mikrovamzdelių, poveikiui (papildomas papildymas, 6 pav.). Be to, apdorojimas kumamonamidu 1, kumamonamido rūgštimi 6 arba KAND 11 neturėjo įtakos mikrovamzdeliams HeLa ląstelėse (papildomas papildymas, 7 pav.). Taigi manoma, kad KAND 11 veikimo mechanizmas skiriasi nuo žinomų citoskeleto ardytojų. Be to, mūsų atliktas mikroskopinis BY-2 ląstelių, paveiktų KAND 11, stebėjimas atskleidė ląstelių žūties pradžią KAND 11 apdorojimo metu ir parodė, kad Evanso mėlynai nudažytų negyvų ląstelių dalis reikšmingai nepadidėjo po 30 min. KAND 11 apdorojimo, o po 90 min. apdorojimo 50 μM arba 100 μM KAND negyvų ląstelių skaičius padidėjo atitinkamai iki 43,7 % arba 80,1 % (7c pav.). Apibendrinus šiuos duomenis, galima teigti, kad naujasis ursolio rūgšties darinys KAND 11 yra augalams būdingas citoskeleto inhibitorius, kurio veikimo mechanizmas anksčiau nebuvo žinomas.
KAND veikia žievės mikrovamzdelius, aktino filamentus ir tabako BY-2 ląstelių gyvybingumą. (a) Žievinės mikrovamzdelių vizualizacija BY-2 ląstelėse, esant TagRFP-TUA6. BY-2 ląstelės, apdorotos KAND 11 (50 μM arba 100 μM) arba DMSO, buvo tiriamos konfokaline mikroskopija. Žievinės mikrovamzdelių tankis buvo apskaičiuotas iš 25 nepriklausomų ląstelių mikrografijų. Raidės rodo reikšmingus skirtumus (Tukey HSD testas, p< 0,05). Mastelio juosta = 10 µm. (b) BY-2 ląstelių žievės aktino filamentai, vizualizuoti esant GFP-ABD2. BY-2 ląstelės, apdorotos KAND 11 (50 μM arba 100 μM) arba DMSO, buvo tiriamos konfokaline mikroskopija. Žievinės aktino filamentų tankis buvo apskaičiuotas iš 25 nepriklausomų ląstelių mikrografijų. Raidės rodo reikšmingus skirtumus (Tukey HSD testas, p< 0,05). Mastelio juosta = 10 µm. (c) Negyvų BY-2 ląstelių stebėjimas Evanso mėlynojo dažymo būdu. BY-2 ląstelės, apdorotos KAND 11 (50 μM arba 100 μM) arba DMSO, buvo tiriamos šviesaus lauko mikroskopu. n = 3. Mastelio juosta = 100 µm.
Naujų natūralių produktų atradimas ir taikymas lėmė didelę pažangą įvairiuose žmogaus gyvenimo aspektuose, įskaitant mediciną ir žemės ūkį. Buvo atlikti istoriniai tyrimai, siekiant gauti naudingų junginių iš gamtos išteklių. Visų pirma, žinoma, kad aktinomicetai yra naudingi kaip antiparazitiniai antibiotikai nematodams dėl jų gebėjimo gaminti įvairius antrinius metabolitus, tokius kaip avermektinas, pagrindinis ivermektino junginys, ir bleomicinas bei jo dariniai, naudojami medicinoje kaip priešvėžinis agentas21,22. Taip pat iš aktinomicetų buvo atrasta įvairių herbicidinių junginių, kai kurie iš jų jau naudojami komerciškai1,23. Todėl aktinomicetų metabolitų analizė, siekiant išskirti natūralius produktus su norimu biologiniu aktyvumu, laikoma veiksminga strategija. Šiame tyrime iš S. werraensis atradome naują junginį – kumamonamidą – ir sėkmingai jį susintetinome. Ursono rūgštis yra sintetinis urbenamido ir jo darinių tarpinis produktas. Ji gali sukelti būdingą šaknų garbanojimąsi, pasižymėti vidutiniu ar stipriu herbicidiniu aktyvumu ir tiesiogiai arba netiesiogiai pažeisti augalų mikrovamzdelius. Tačiau urmotono rūgšties veikimo mechanizmas gali skirtis nuo esamų mikrovamzdelių inhibitorių, nes KAND 11 taip pat ardo aktino filamentus ir sukelia ląstelių mirtį, o tai rodo reguliavimo mechanizmą, kuriuo urmotono rūgštis ir jos dariniai veikia platų citoskeleto struktūrų spektrą.
Išsamesnė urbenono rūgšties charakteristika padės geriau suprasti jos veikimo mechanizmą. Kitas tikslas – įvertinti ursono rūgšties gebėjimą prisijungti prie redukuotų mikrovamzdelių, siekiant nustatyti, ar ursono rūgštis ir jos dariniai veikia tiesiogiai mikrovamzdelius ir juos depolimerizuoja, ar jų veikimas sukelia mikrovamzdelių destabilizaciją. Be to, tais atvejais, kai mikrovamzdeliai nėra tiesioginis taikinys, ursono rūgšties veikimo vietos ir molekulinių taikinių augalų ląstelėse nustatymas padės geriau suprasti susijusių junginių savybes ir galimus būdus, kaip pagerinti herbicidinį aktyvumą. Mūsų atliktas bioaktyvumo tyrimas atskleidė unikalų ursono rūgšties citotoksinį gebėjimą augalų, tokių kaip Arabidopsis thaliana, tabakas ir kepenų misa, augimui, tuo tarpu nei E. coli, nei HeLa ląstelės nebuvo paveiktos. Mažas arba jo nebuvimas gyvūnų ląstelėms yra ursono rūgšties darinių privalumas, jei jie kuriami kaip herbicidai, skirti naudoti atviruose žemės ūkio laukuose. Iš tiesų, kadangi mikrovamzdeliai yra įprastos struktūros eukariotuose, jų selektyvus slopinimas augaluose yra pagrindinis herbicidų reikalavimas. Pavyzdžiui, propizamidas, mikrovamzdelių depolimerizuojantis agentas, kuris tiesiogiai jungiasi prie tubulino ir slopina polimerizaciją, yra naudojamas kaip herbicidas dėl mažo toksiškumo gyvūnų ląstelėms24. Priešingai nei disopiramidas, susiję benzamidai pasižymi skirtingu taikinių specifiškumu. Be augalų mikrovamzdelių, RH-4032 arba benzoksamidas taip pat slopina atitinkamai gyvūnų ląstelių arba oomicetų mikrovamzdelius, o zalilamidas naudojamas kaip fungicidas dėl mažo fitotoksiškumo25,26,27. Naujai atrastas meškiukas ir jo dariniai pasižymi selektyviu citotoksiškumu augalams, tačiau verta paminėti, kad tolesnės modifikacijos gali pakeisti jų taikinių specifiškumą, potencialiai suteikdamos papildomų darinių patogeninių grybų arba oomicetų kontrolei.
Unikalios urbenono rūgšties ir jos darinių savybės yra naudingos kuriant juos kaip herbicidus ir naudojant kaip tyrimų įrankius. Citoskeleto svarba kontroliuojant augalų ląstelių formą yra plačiai pripažįstama. Ankstesni tyrimai parodė, kad augalai išvystė sudėtingus žievės mikrovamzdelių organizacijos mechanizmus, kontroliuodami mikrovamzdelių dinamiką, kad tinkamai kontroliuotų morfogenezę. Nustatyta daug molekulių, atsakingų už mikrovamzdelių aktyvumo reguliavimą, ir susiję tyrimai vis dar vyksta3,4,28. Dabartinis mūsų supratimas apie mikrovamzdelių dinamiką augalų ląstelėse nevisiškai paaiškina žievės mikrovamzdelių organizacijos mechanizmus. Pavyzdžiui, nors ir dizopiramidas, ir orizalinas gali depolimerizuoti mikrovamzdelius, disopiramidas sukelia didelį šaknų iškraipymą, o orizalinas turi santykinai silpną poveikį. Be to, tubulino, kuris stabilizuoja mikrovamzdelius, mutacijos taip pat sukelia šaknų dekstrorotaciją, o paklitakselis, kuris taip pat stabilizuoja mikrovamzdelių dinamiką, to nesukelia. Todėl ursolio rūgšties molekulinių taikinių tyrimas ir nustatymas turėtų suteikti naujų įžvalgų apie augalų žievės mikrovamzdelių reguliavimą. Taip pat būsimi cheminių medžiagų, kurios veiksmingai skatina iškreiptą augimą, pvz., disopiramido, ir mažiau veiksmingų cheminių medžiagų, pvz., orizalino ar kumamotorinės rūgšties, palyginimai suteiks užuominų apie tai, kaip vyksta iškreiptas augimas.
Kita vertus, su gynyba susiję citoskeleto pertvarkymai yra dar viena galimybė paaiškinti ursono rūgšties citotoksiškumą. Patogeno infekcija arba elicitoriaus įvedimas į augalų ląsteles kartais sukelia citoskeleto sunaikinimą ir vėlesnę ląstelių žūtį29. Pavyzdžiui, pranešta, kad iš oomicetų gautas kriptoksantinas sutrikdo mikrovamzdelius ir aktino filamentus prieš tabako ląstelių žūtį, panašiai kaip tai vyksta gydant KAND30,31. Panašumai tarp gynybinių reakcijų ir ursono rūgšties sukeltų ląstelinių reakcijų leido mums kelti hipotezę, kad jos sukelia įprastus ląstelinius procesus, nors akivaizdus greitesnis ir stipresnis ursono rūgšties poveikis nei kriptoksantino. Tačiau tyrimai parodė, kad aktino filamentų sutrikdymas skatina savaiminę ląstelių žūtį, kuri ne visada lydima mikrovamzdelių sutrikimo29. Be to, dar reikia išsiaiškinti, ar patogenas ar elicitorius sukelia iškreiptą šaknų augimą, kaip tai daro ursono rūgšties dariniai. Taigi, molekulinės žinios, siejančios gynybinius atsakus ir citoskeletą, yra patraukli problema, kurią reikia spręsti. Išnaudodami mažos molekulinės masės junginius, susijusius su ursono rūgštimi, taip pat įvairius darinius su skirtingu stiprumu, jie gali suteikti galimybių nukreipti dėmesį į nežinomus ląstelių mechanizmus.
Apibendrinant, naujų junginių, moduliuojančių mikrovamzdelių dinamiką, atradimas ir taikymas suteiks veiksmingų metodų, skirtų spręsti sudėtingus molekulinius mechanizmus, lemiančius augalų ląstelių formą. Šiame kontekste neseniai sukurtas junginys urmotono rūgštis, kuri veikia mikrovamzdelius ir aktino filamentus bei sukelia ląstelių mirtį, gali suteikti galimybę iššifruoti ryšį tarp mikrovamzdelių kontrolės ir šių kitų mechanizmų. Taigi, cheminė ir biologinė analizė naudojant urbenono rūgštį padės mums suprasti molekulinius reguliavimo mechanizmus, kurie kontroliuoja augalo citoskeletą.
S. werraensis MK493-CF1 inokuliuojama į 500 ml talpos Erlenmejerio kolbą su pertvara, kurioje yra 110 ml sėklų terpės, sudarytos iš 2 % (m/t) galaktozės, 2 % (m/t) esencijos pastos, 1 % (m/t) „Bacto“ kompozicijos. Soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5 % (m/t) kukurūzų ekstrakto (KOGOSTCH Co., Ltd., Japonija), 0,2 % (m/t) (NH4)2SO4 ir 0,2 % CaCO3 dejonizuotame vandenyje (pH 7,4 prieš sterilizavimą). Sėklų kultūros buvo inkubuojamos rotacinėje kratytuvėje (180 aps./min.) 27 °C temperatūroje 2 dienas. Produktyvus kultivavimas kietosios fazės fermentacijos būdu. Sėklinė kultūra (7 ml) buvo perkelta į 500 ml K-1 kolbą, kurioje buvo 40 g gamybos terpės, sudarytos iš 15 g presuotų miežių (MUSO Co., Ltd., Japonija) ir 25 g dejonizuoto vandens (pH prieš sterilizavimą nebuvo koreguotas). Fermentacija buvo vykdoma 30 °C temperatūroje tamsoje 14 dienų. Fermentacijos medžiaga buvo ekstrahuota 40 ml/buteliu EtOH ir centrifuguota (1500 g, 4 °C, 10 min.). Kultūros supernatantas (60 ml) buvo ekstrahuotas 10 % MeOH/EtOAc mišiniu. Organinis sluoksnis buvo išgarintas sumažintame slėgyje, gaunant likučius (59,5 mg), kurie buvo chromatografuoti HPLC metodu su gradientiniu eliuavimu (0–10 minučių: 90 %) atvirkštinės fazės kolonėlėje (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × ilgis 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 minutės: 90 % H2O/CH3CN iki 70 % H2O/CH3CN (gradientas), 35–45 minutės: 90 % H2O/EtOH, 45–155 minutės: 90 % H2O/EtOH iki 100 % EtOH (gradientas), 155–200 min.: 100 % EtOH), esant 1,5 ml/min. srauto greičiui. Išskirtas kumamonamidas (1, 36,0 mg) baltų amorfinių miltelių pavidalu.
Kumamotoamidas(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz 1H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1H). ), 4,08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ apskaičiuota vertė: 141,0659, išmatuota vertė: 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Kolumbijos sėklos (Col-0) buvo gautos iš Arabidopsis biologinių išteklių centro (ABRC) gavus leidimą naudoti tyrimuose. Col-0 sėklos buvo dauginamos ir auginamos mūsų laboratorinėmis sąlygomis ir naudojamos kaip laukinio tipo Arabidopsis augalai. Arabidopsis sėklos buvo sterilizuotos paviršiumi ir kultivuojamos pusiau koncentruotoje Murashige ir Skoog terpėje, kurioje yra 2 % sacharozės („Fujifilm Wako Pure Chemical“), 0,05 % (m/t) 2-(4-morfolino)etansulfonrūgšties (MES) („Fujifilm Wako Pure Chemical“) ir 1,5 % agaro („Fujifilm Wako Pure Chemical“), pH 5,7, 23 °C temperatūroje ir nuolatinėje šviesoje. phs1-1 mutanto sėklas pateikė T. Hashimoto (Naros mokslo ir technologijos institutas).
SR-1 padermės sėklas pateikė T. Hashimoto (Naros mokslo ir technologijos institutas) ir jos buvo naudojamos kaip laukinio tipo tabako augalai. Tabako sėklos buvo sterilizuotos paviršiuje ir tris naktis mirkomos steriliame vandenyje, kad paskatintų dygimą, tada dedamos į pusiau koncentruotą tirpalą, kuriame yra 2 % sacharozės, 0,05 % (m/t) MES ir 0,8 % gelano dervos („Fujifilm Wako Pure Chemical“) (Murashige ir Skoog terpė), kurio pH yra 5,7, ir inkubuojamos 23 °C temperatūroje nuolatinėje šviesoje.
Tak-1 padermę pateikė T. Kohchi (Kioto universitetas) ir ji buvo naudojama kaip standartinis eksperimentinis vienetas kepenų žolės tyrime. Gemma buvo gauta iš sterilizuotų kultūrinių augalų, o po to pasėta ant Gamborg B5 terpės („Fujifilm Wako Pure Chemical“), kurioje yra 1 % sacharozės ir 0,3 % gelano dervos, ir inkubuota 23 °C temperatūroje nuolatinėje šviesoje.
Tabako BY-2 ląsteles (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) pateikė S. Hasezawa (Tokijo universitetas). BY-2 ląstelės buvo 95 kartus praskiestos modifikuotoje Linsmeier ir Skoog terpėje ir kas savaitę papildytos 2,4-dichlorfenoksiacto rūgštimi 32. Ląstelių suspensija buvo maišoma rotacinėje kratytuvėje 130 aps./min. greičiu 27 °C temperatūroje tamsoje. Ląstelės plaunamos 10 kartų didesniu šviežios terpės tūriu ir resuspenduojamos toje pačioje terpėje. BY-2 transgeninės ląstelių linijos, stabiliai ekspresuojančios mikrovamzdelių žymeklį TagRFP-TUA6 arba aktino filamentų žymeklį GFP-ABD2, esant žiedinių kopūstų mozaikos viruso 35S promotoriui, buvo sugeneruotos, kaip aprašyta 33, 34, 35. Šias ląstelių linijas galima prižiūrėti ir sinchronizuoti naudojant procedūras, panašias į tas, kurios buvo naudojamos originaliai BY-2 ląstelių linijai.
HeLa ląstelės buvo kultivuojamos Dulbeko modifikuotoje Eagle terpėje (DMEM) („Life Technologies“), papildytoje 10 % vaisiaus galvijų serumu, 1,2 U/ml penicilino ir 1,2 μg/ml streptomicino, 37 °C temperatūros inkubatoriuje su 5 % CO2.
Visi šiame rankraštyje aprašyti eksperimentai buvo atlikti laikantis Japonijos biosaugos taisyklių ir gairių.
Junginiai buvo ištirpinti dimetilsulfoksido (DMSO; „Fujifilm Wako Pure Chemical“) tirpaluose ir praskiesti MS terpėje, skirtoje Arabidopsis ir tabakui, arba Gamborg B5 terpėje, skirtoje kepenų misai. Šaknų augimo slopinimo tyrimui daugiau nei 10 sėklų į vieną lėkštelę buvo pasėta ant agaro terpės, kurioje buvo nurodyti junginiai arba DMSO. Sėklos 7 dienas buvo inkubuojamos auginimo kameroje. Daigai buvo nufotografuoti ir išmatuotas šaknų ilgis. Arabidopsis dygimo tyrimui 48 sėklos į vieną lėkštelę buvo pasėtos ant agaro terpės, kurioje buvo 200 μM junginio arba DMSO. Arabidopsis sėklos buvo auginamos auginimo kameroje, o sudygusių daigų skaičius buvo skaičiuojamas praėjus 7 dienoms po sudygimo (dag). Tabako dygimo tyrimui 24 sėklos į vieną lėkštelę buvo pasėtos ant agaro terpės, kurioje buvo 200 μM KAND arba DMSO. Tabako sėklos buvo auginamos auginimo kameroje, o sudygusių daigų skaičius buvo skaičiuojamas po 14 dienų. Kepenų misos augimo slopinimo tyrimui 9 embrionai iš kiekvienos plokštelės buvo dedami ant agaro terpės, kurioje buvo nurodytos KAND arba DMSO koncentracijos, ir inkubuojami augimo kameroje 14 dienų.
Šaknų meristemos organizacijai vizualizuoti naudoti daigus, nudažytus 5 mg/ml propidžio jodidu (PI). PI signalai buvo stebimi fluorescencine mikroskopija, naudojant TCS SPE konfokalinį lazerinį skenuojantį mikroskopą („Leica Microsystems“).
Šaknų histocheminis dažymas β-gliukuronidaze (GUS) buvo atliktas pagal Malami ir Benfey36 aprašytą protokolą. Daigai buvo fiksuoti 90 % acetone per naktį, 1 valandą dažomi 0,5 mg/ml 5-brom-4-chlor-3-indolil-β-d-gliukurono rūgštimi GUS buferyje ir dedami į hidratuotą chloraldehido tirpalą (8 g chloralio hidrato, 2 ml vandens ir 1 ml glicerolio) ir stebimi diferencinės interferencijos kontrastinės mikroskopijos būdu, naudojant „Axio Imager M1“ mikroskopą (Carl Zeiss).
Šaknų kampai buvo matuojami 7 dienų daigams, auginamiems ant vertikaliai pastatytų lėkščių. Šaknų kampą matuokite gravitacijos vektoriaus kryptimi, kaip aprašyta 6 veiksme.
Žievinės mikrovamzdelių išsidėstymas buvo stebimas, kaip aprašyta, su nedideliais protokolo pakeitimais 37. Kaip pirminiai ir antriniai antikūnai buvo naudojami anti-β-tubulino antikūnai (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) ir Alexa Fluor 488 konjuguotas anti-pelės IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723), atitinkamai skiedžiant 1:1000 ir 1:100. Fluorescenciniai vaizdai buvo gauti naudojant TCS SPE konfokalinį lazerinį skenuojantį mikroskopą (Leica Microsystems). Gaukite Z formos vaizdus ir sukurkite maksimalaus intensyvumo projekcijas pagal gamintojo instrukcijas.
HeLa ląstelių proliferacijos tyrimas buvo atliktas naudojant ląstelių skaičiavimo rinkinį 8 (Dojindo) pagal gamintojo instrukcijas.
E. coli DH5α augimas buvo analizuojamas matuojant ląstelių tankį kultūroje spektrofotometru esant 600 nm bangos ilgiui (OD600).
Transgeninių BY-2 ląstelių citoskeleto organizacija buvo stebima naudojant fluorescencinį mikroskopą su CSU-X1 konfokalinio skenavimo įrenginiu („Yokogawa“) ir sCMOS kamera („Zyla“, „Andor Technology“). Citoskeleto tankis buvo įvertintas vaizdų analize, kurios metu, naudojant aprašytą „ImageJ“ programinę įrangą, buvo kiekybiškai įvertintas citoskeleto pikselių procentas tarp citoplazminių pikselių konfokaliniuose vaizduose.
Norint aptikti BY-2 ląstelių žūtį, ląstelių suspensijos alikvotinė dalis buvo inkubuojama su 0,05 % Evanso mėlynuoju 10 minučių kambario temperatūroje. Selektyvus negyvų ląstelių dažymas Evanso mėlynuoju priklauso nuo dažų išstūmimo iš gyvybingų ląstelių per nepažeistą plazminę membraną40. Nudažytos ląstelės buvo stebimos naudojant šviesaus lauko mikroskopą (BX53, „Olympus“).
HeLa ląstelės buvo auginamos DMEM terpėje, papildytoje 10 % FBS, drėkinamoje inkubatoriuje 37 °C temperatūroje ir 5 % CO2 atmosferoje. Ląstelės 6 valandas 37 °C temperatūroje buvo veikiamos 100 μM KAND 11, kumamonamo rūgštimi 6, kumamonamidu 1, 100 ng/ml kolcemidu (Gibco) arba 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma). Ląstelės 10 min. buvo fiksuotos MetOH, o po to 5 min. su acetatu kambario temperatūroje. Fiksuotos ląstelės 2 valandas buvo inkubuojamos su β-tubulino pirminiu antikūnu (1D4A4, Proteintech: 66240-1), praskiestu 0,5 % BSA/PBS, 3 kartus praplaunamos TBST, o po to 1 valandą inkubuojamos su Alexa Fluor ožkos antikūnu. 488 – Pelės IgG („Thermo Fisher Scientific“: A11001) ir 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI), praskiesto 0,5 % BSA/PBS. Tris kartus praplovus TBST, nudažytos ląstelės buvo stebimos apverstu „Nikon Eclipse Ti-E“ mikroskopu. Vaizdai buvo užfiksuoti atvėsinta „Hamamatsu ORCA-R2 CCD“ kamera naudojant „MetaMorph“ programinę įrangą („Molecular Devices“).
Įrašo laikas: 2024 m. birželio 17 d.