Pušų nematodas yra karantininis migruojantis endoparazitas, sukeliantis didelių ekonominių nuostolių pušynų ekosistemose. Šiame tyrime apžvelgiamas halogenintų indolų nematocidinis aktyvumas prieš pušų nematodus ir jų veikimo mechanizmas. 5-jodoindolio ir avermektino (teigiama kontrolė) nematocidinis aktyvumas prieš pušinius nematodus buvo panašus ir didelis, esant mažoms koncentracijoms (10 μg/ml). 5-jodoindolas sumažino vaisingumą, reprodukcinį aktyvumą, embrionų ir lervų mirtingumą ir lokomotorinį elgesį. Molekulinė ligandų sąveika su bestuburiams specifiniais glutamato chlorido kanalų receptoriais patvirtina mintį, kad 5-jodoindolas, kaip ir avermektinas, glaudžiai jungiasi su receptorių aktyvia vieta. 5-jodoindolas taip pat sukėlė įvairias fenotipines nematodų deformacijas, įskaitant nenormalų organų žlugimą / susitraukimą ir padidėjusį vakuolizaciją. Šie rezultatai rodo, kad vakuolės gali turėti įtakos nematodų metilinimo sukeltai mirtimi. Svarbu tai, kad 5-jodoindolas nebuvo toksiškas abiem augalų rūšims (kopūstams ir ridikams). Taigi šis tyrimas rodo, kad jodoindolio naudojimas aplinkos sąlygomis gali kontroliuoti pušies vytimo sužalojimą.
Pušų nematodas (Bursaphelenchus xylophilus) priklauso pušies nematodams (PWN), migruojantiems endoparazitiniams nematodams, kurie, kaip žinoma, daro didelę ekologinę žalą pušynų ekosistemoms1. Pušų nematodo sukelta pušų vytulio liga (PWD) tampa rimta problema keliuose žemynuose, įskaitant Aziją ir Europą, o Šiaurės Amerikoje nematodas naikina introdukuotas pušų rūšis1,2. Pušų nykimas yra pagrindinė ekonominė problema, o jos išplitimo visame pasaulyje tikimybė kelia nerimą3. Dažniausiai nematodas puola šias pušų rūšis: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii ir Pinus radiata4. Pušų nematodas yra rimta liga, kuri gali nužudyti pušis per kelias savaites ar mėnesius nuo užsikrėtimo. Be to, pušų nematodų protrūkiai yra dažni įvairiose ekosistemose, todėl buvo nustatytos nuolatinės infekcijos grandinės1.
Bursaphelenchus xylophilus yra karantininis augalas-parazitinis nematodas, priklausantis Aphelenchoidea virššeimiui ir 102.5 kladui. Nematodas minta grybais ir dauginasi pušų medienos audiniuose, išsivystydamas į keturias skirtingas lervos stadijas: L1, L2, L3, L4 ir suaugusį individą1,6. Maisto stygiaus sąlygomis pušies nematodas pereina į specializuotą lervos tarpsnį – dauerį, kuris parazituoja savo vektorių – pušų žievėgraužį (Monochamus alternatus) ir perkeliamas į sveikas pušį. Sveikiems šeimininkams nematodai greitai migruoja per augalų audinius ir minta parenchiminėmis ląstelėmis, o tai sukelia daugybę padidėjusio jautrumo reakcijų, pušų vytimo ir mirties per metus po užsikrėtimo1,7,8.
Biologinė pušinių nematodų kontrolė jau seniai buvo iššūkis – karantino priemonės siekia XX a. Dabartinės pušų nematodų kontrolės strategijos pirmiausia apima cheminį apdorojimą, įskaitant medienos fumigaciją ir nematocidų implantavimą į medžių kamienus. Dažniausiai naudojami nematicidai yra avermektinas ir avermektino benzoatas, priklausantys avermektinų šeimai. Šios brangios cheminės medžiagos yra labai veiksmingos prieš daugelį nematodų rūšių ir laikomos saugiomis aplinkai9. Tačiau tikimasi, kad pakartotinis šių nematocidų naudojimas sukels atrankos spaudimą, kuris beveik neabejotinai sukels atsparių pušinių nematodų atsiradimą, kaip buvo įrodyta keliems kenkėjams, pvz., Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella ir nematodams Trichostrongylus colubriformis ir Ostertagia circumcincta, kurie palaipsniui išsivystė atsparumui10. Todėl atsparumo modelius reikia reguliariai tirti ir nuolat tikrinti nematocidus, kad būtų galima rasti alternatyvių, ekonomiškų ir aplinkai nekenksmingų priemonių PVD kontrolei. Pastaraisiais dešimtmečiais nemažai autorių pasiūlė naudoti augalų ekstraktus, eterinius aliejus ir lakiąsias medžiagas kaip nematodų kontrolės priemones13,14,15,16.
Neseniai parodėme indolo, tarpląstelinės ir tarpvalstybinės signalizacijos molekulės, nematocidinį aktyvumą Caenorhabditis elegans 17 . Indolas yra plačiai paplitęs tarpląstelinis signalas mikrobų ekologijoje, kontroliuojantis daugybę funkcijų, turinčių įtakos mikrobų fiziologijai, sporų susidarymui, plazmidės stabilumui, atsparumui vaistams, bioplėvelių susidarymui ir virulentiškumui 18, 19 . Indolo ir jo darinių aktyvumas prieš kitus patogeninius nematodus netirtas. Šiame tyrime mes ištyrėme 34 indolų nematocidinį aktyvumą prieš pušų nematodus ir išaiškinome galingiausio 5-jodoindolo veikimo mechanizmą, naudodami mikroskopijos, fotografavimo ir molekulinio prijungimo eksperimentus, ir įvertinome jo toksinį poveikį augalams, naudodami sėklų daigumo tyrimą.
Anksčiau buvo pranešta, kad didelės (> 1,0 mM) indolo koncentracijos nematodams turi nematocidinį poveikį17. Po B. xylophilus (mišrių gyvenimo etapų) apdorojimo indolu arba 33 skirtingais indolo dariniais, esant 1 mM, B. xylophilus mirtingumas buvo matuojamas skaičiuojant gyvus ir negyvus nematodus kontrolinėje ir gydomose grupėse. Penki indolai pasižymėjo reikšmingu nematocidiniu aktyvumu; negydytos kontrolinės grupės išgyvenamumas buvo 95 ± 7 % po 24 val. Iš 34 tirtų indolų 1 mM 5-jodoindolas ir 4-fluoroindolas sukėlė 100 % mirtingumą, o 5,6-difluoroindigo, metilindol-7-karboksilatas ir 7-jodoindolas – maždaug 50 % (1 lentelė).
5-jodoindolo įtaka pušies medienos nematodo vakuolių susidarymui ir metabolizmui. (A) Avermektino ir 5-jodoindolo poveikis suaugusiems nematodų patinams, (B) L1 stadijos nematodų kiaušinėliams ir (C) B. xylophilus metabolizmui, (i) vakuolės nebuvo pastebėtos po 0 val., gydymas sukėlė (ii) vakuoles, (iii) susikaupė, (iv) daugybinių vakuolių, v. vakuolės ir (vi) milžiniškų vakuolių susidarymas. Raudonos rodyklės rodo vakuolių patinimą, mėlynos rodyklės rodo vakuolių susiliejimą, o juodos rodyklės rodo milžiniškas vakuoles. Mastelio juosta = 50 μm.
Be to, šiame tyrime taip pat aprašytas nuoseklus metano sukeltos pušų nematodų mirties procesas (4C pav.). Metanogeninė mirtis yra neapoptozinis ląstelių mirties tipas, susijęs su ryškių citoplazminių vakuolių kaupimu27. Atrodo, kad pušų nematoduose pastebėti morfologiniai defektai yra glaudžiai susiję su metano sukeltos mirties mechanizmu. Mikroskopinis tyrimas skirtingu laiku parodė, kad po 20 valandų poveikio 5-jodoindolui (0,1 mM) susidarė milžiniškos vakuolės. Mikroskopinės vakuolės buvo pastebėtos po 8 valandų gydymo, o jų skaičius padidėjo po 12 valandų. Po 14 valandų buvo pastebėtos kelios didelės vakuolės. Kelios susiliejusios vakuolės buvo aiškiai matomos po 12–16 valandų gydymo, o tai rodo, kad vakuolių susiliejimas yra metanogeninio mirties mechanizmo pagrindas. Po 20 valandų visame kirmelyje buvo rasta keletas milžiniškų vakuolių. Šie stebėjimai yra pirmasis pranešimas apie C. elegans metuozę.
5-jodoindolu gydytų kirmėlių atveju taip pat buvo pastebėta vakuolių agregacija ir plyšimas (5 pav.), ką rodo kirminų lenkimas ir vakuolės patekimas į aplinką. Vakuolės sutrikimas taip pat buvo pastebėtas kiaušinio lukšto membranoje, kurią perinti paprastai išsaugo L2 (papildomas S2 pav.). Šie stebėjimai patvirtina skysčių kaupimosi ir osmoreguliacijos sutrikimo, taip pat grįžtamojo ląstelių pažeidimo (RCI) dalyvavimą vakuolių susidarymo ir pūlimo procese (5 pav.).
Iškeldami hipotezę apie jodo vaidmenį stebimų vakuolių formavime, ištyrėme natrio jodido (NaI) ir kalio jodido (KI) nematocidinį aktyvumą. Tačiau esant koncentracijoms (0,1, 0,5 arba 1 mM), jie neturėjo įtakos nei nematodų išgyvenimui, nei vakuolių susidarymui (papildomas S5 pav.), nors 1 mM KI turėjo nedidelį nematocidinį poveikį. Kita vertus, 7-jodoindolas (1 arba 2 mM), kaip ir 5-jodoindolas, sukėlė daugybę vakuolių ir struktūrinių deformacijų (papildomas S6 pav.). Dviejų jodoindolų pušies nematodų fenotipinės savybės buvo panašios, o NaI ir KI – ne. Įdomu tai, kad tirtomis koncentracijomis indolas nesukėlė vakuolių susidarymo B. xylophilus (duomenys nerodomi). Taigi rezultatai patvirtino, kad indolo-jodo kompleksas yra atsakingas už B. xylophilus vakuolizaciją ir metabolizmą.
Iš indolų, tirtų dėl nematocidinio aktyvumo, didžiausias slydimo indeksas buvo 5-jodoindolas – -5,89 kcal/mol, po to seka 7-jodoindolas (-4,48 kcal/mol), 4-fluoroindolas (-4,33) ir indolas (-4,03) (6 pav.). Stiprus 5-jodoindolo pagrindo vandenilinis ryšys su leucinu 218 stabilizuoja jo jungimąsi, o visi kiti indolo dariniai jungiasi prie serino 260 per šoninės grandinės vandenilinius ryšius. Tarp kitų modeliuojamų jodoindolų, 2-jodoindolas turi -5,248 kcal/mol, o tai yra dėl jo pagrindinės vandenilio jungties su leucinu 218. Kiti žinomi jungikliai yra 3-jodoindolas (-4,3 kcal/mol), 4-jodoindolas (-4,0 kcal/mol) ir 6,0 kcal (2-fluoroindolas). kcal / mol) (papildomas S8 paveikslas). Dauguma halogenintų indolų ir pats indolas, išskyrus 5-jodoindolą ir 2-jodoindolą, sudaro ryšį su serinu 260. Tai, kad vandenilinis ryšys su leucinu 218 rodo veiksmingą receptorių ir ligando jungimąsi, kaip pastebėta ivermektino atveju (papildomas S5 ir iodoindo pav.). 2-jodoindolas, kaip ir ivermektinas, per leuciną 218 glaudžiai jungiasi prie aktyvios GluCL receptoriaus vietos (6 pav. ir papildomas S8 pav.). Siūlome, kad šis surišimas būtų reikalingas GluCL komplekso atvirų porų struktūrai palaikyti ir kad 5-jodoindolas, 2-jodoindolas, avermektinas ir ivermektinas, glaudžiai prisijungę prie aktyvios GluCL receptoriaus vietos, išlaikytų atvirą jonų kanalą ir leistų įsisavinti skysčius.
Indolo ir halogeninto indolo molekulinis prijungimas prie GluCL. (A) indolo, (B) 4-fluoroindolio, (C) 7-jodoindolo ir (D) 5-jodoindolo ligandų jungimosi orientacijos prie aktyvios GluCL vietos. Baltymas pavaizduotas juostele, o pagrindiniai vandenilio ryšiai rodomi kaip geltonos punktyrinės linijos. (A'), (B'), (C') ir (D') rodo atitinkamų ligandų sąveiką su aplinkinėmis aminorūgščių liekanomis, o šoninės grandinės vandenilio ryšiai žymimi rožinėmis punktyrinėmis rodyklėmis.
Buvo atlikti eksperimentai, siekiant įvertinti toksinį 5-jodoindolo poveikį kopūstų ir ridikėlių sėklų daigumui. 5-jodoindolas (0,05 arba 0,1 mM) arba avermektinas (10 μg/mL) turėjo mažai įtakos pradiniam daigumui ir augalų atsiradimui arba jo neturėjo (7 pav.). Be to, reikšmingo skirtumo tarp neapdorotų kontrolinių mėginių ir sėklų, apdorotų 5-jodoindolu arba avermektinu, dygimo greičio nenustatyta. Poveikis liemeninių šaknų pailgėjimui ir susidariusių šoninių šaknų skaičiui buvo nereikšmingas, nors 1 mM (10 kartų aktyvi jo koncentracija) 5-jodoindolas šiek tiek atitolino šoninių šaknų vystymąsi. Šie rezultatai rodo, kad 5-jodoindolas nėra toksiškas augalų ląstelėms ir netrukdo augalų vystymosi procesams tirtomis koncentracijomis.
5-jodoindolo poveikis sėklų daigumui. B. oleracea ir R. raphanistrum sėklų daigumas, dygimas ir šoninis įsišaknijimas Murashige ir Skoog agaro terpėje su avermektinu arba 5-jodoindolu arba be jo. Dygimas buvo užfiksuotas po 3 dienų inkubacijos 22 ° C temperatūroje.
Šiame tyrime pranešama apie kelis nematodų nužudymo indolais atvejus. Svarbu tai, kad tai yra pirmasis pranešimas apie jodoindolą, sukeliantį metilinimą (procesą, kurį sukelia mažų vakuolių, kurios palaipsniui susilieja į milžiniškas vakuoles, kurios galiausiai sukelia membranos plyšimą ir mirtį), pušų spygliuose, o jodoindolas pasižymi reikšmingomis nematicidinėmis savybėmis, panašiomis į komercinio nematicido avermino savybes.
Anksčiau buvo pranešta, kad indolai prokariotuose ir eukariotuose atlieka daugybę signalizacijos funkcijų, įskaitant bioplėvelės slopinimą / formavimąsi, bakterijų išgyvenimą ir patogeniškumą 19, 32, 33, 34. Pastaruoju metu galimas terapinis halogenintų indolų, indolo alkaloidų ir pusiau sintetinių indolo darinių poveikis sulaukė didelio mokslinio susidomėjimo35,36,37. Pavyzdžiui, buvo įrodyta, kad halogeninti indolai naikina patvarias Escherichia coli ir Staphylococcus aureus ląsteles37. Be to, yra moksliškai įdomu ištirti halogenintų indolų veiksmingumą prieš kitas rūšis, gentis ir karalystes, ir šis tyrimas yra žingsnis siekiant šio tikslo.
Čia mes siūlome 5-jodoindolo sukelto C. elegans mirtingumo mechanizmą, pagrįstą grįžtamuoju ląstelių pažeidimu (RCI) ir metilinimu (4C ir 5 pav.). Edeminiai pokyčiai, tokie kaip patinimas ir vakuolinė degeneracija, yra RCI ir metilinimo rodikliai, pasireiškiantys kaip milžiniškos vakuolės citoplazmoje48, 49. RCI trukdo energijos gamybai, sumažindamas ATP gamybą, sukeldamas ATPazės siurblio gedimą arba suardydamas ląstelių membranas ir sukeldamas greitą Na+, Ca2+ ir vandens antplūdį50,51,52. Intracitoplazminės vakuolės atsiranda gyvūnų ląstelėse dėl skysčių kaupimosi citoplazmoje dėl Ca2+ ir vandens antplūdžio53. Įdomu tai, kad šis ląstelių pažeidimo mechanizmas yra grįžtamas, jei pažeidimas yra laikinas ir ląstelės pradeda gaminti ATP tam tikrą laiką, tačiau jei pažeidimas išlieka arba pablogėja, ląstelės miršta.54 Mūsų stebėjimai rodo, kad 5-jodoindolu apdoroti nematodai negali atkurti normalios biosintezės po streso sąlygų.
Metilinimo fenotipas, kurį sukelia 5-jodoindolas B. xylophilus, gali būti dėl jodo buvimo ir jo molekulinio pasiskirstymo, nes 7-jodoindolas turėjo mažesnį slopinamąjį poveikį B. xylophilus nei 5-jodoindolas (1 lentelė ir papildomas S6 paveikslas). Šie rezultatai iš dalies atitinka Maltos ir kt. (2014), kuris pranešė, kad piridilo azoto fragmento perkėlimas indolyje iš para- į meta padėtį panaikino vakuolizaciją, augimo slopinimą ir citotoksiškumą U251 ląstelėse, o tai rodo, kad molekulės sąveika su specifine aktyvia vieta baltyme yra labai svarbi27, 44, 45. Šiame tyrime pastebėta indolo arba halogenintų indolų ir GluCL receptorių sąveika taip pat patvirtina šią mintį, nes buvo nustatyta, kad 5- ir 2-jodoindolas jungiasi prie GluCL receptorių stipriau nei kiti tirti indolai (6 paveikslas ir papildomas S8 paveikslas). Nustatyta, kad antroje arba penktoje indolo padėtyje esantis jodas jungiasi prie GluCL receptoriaus leucino 218 per pagrindinius vandenilio ryšius, o kiti halogeninti indolai ir pats indolas sudaro silpnas šoninės grandinės vandenilio jungtis su serinu 260 (6 pav.). Todėl mes spėliojame, kad halogeno lokalizacija vaidina svarbų vaidmenį sukeliant vakuolinę degeneraciją, o glaudus 5-jodoindolio surišimas išlaiko jonų kanalą atvirą, taip leisdamas greitai skysčiams pritekėti ir plyšti vakuolę. Tačiau detalus 5-jodoindolo veikimo mechanizmas dar turi būti nustatytas.
Prieš praktiškai naudojant 5-jodoindolą, reikia išanalizuoti jo toksinį poveikį augalams. Mūsų atlikti sėklų daiginimo eksperimentai parodė, kad tirtomis koncentracijomis 5-jodoindolas neturėjo neigiamo poveikio sėklų dygimui ar tolesniems vystymosi procesams (7 pav.). Taigi šis tyrimas suteikia pagrindą 5-jodoindolui naudoti ekologinėje aplinkoje, siekiant kontroliuoti pušinių nematodų kenksmingumą pušams.
Ankstesnėse ataskaitose buvo įrodyta, kad gydymas indolu yra galimas būdas spręsti atsparumo antibiotikams ir vėžio progresavimo problemą55. Be to, indolai turi antibakterinį, priešvėžinį, antioksidacinį, priešuždegiminį, antidiabetinį, antivirusinį, antiproliferacinį ir antituberkuliozės poveikį ir gali būti perspektyvus vaistų kūrimo pagrindas56,57. Šis tyrimas pirmą kartą rodo, kad jodas gali būti naudojamas kaip antiparazitinis ir antihelmintinis agentas.
Avermektinas buvo atrastas prieš tris dešimtmečius ir 2015 m. laimėjo Nobelio premiją, o kaip antihelmintinis vaistas vis dar aktyviai naudojamas. Tačiau dėl sparčiai besivystančio nematodų ir vabzdžių kenkėjų atsparumo avermektinams, reikalinga alternatyvi, nebrangi ir aplinkai nekenksminga strategija pušų PN infekcijai kontroliuoti. Šiame tyrime taip pat pranešama apie mechanizmą, pagal kurį 5-jodoindolas naikina pušų nematodus ir kad 5-jodoindolas yra mažai toksiškas augalų ląstelėms, o tai atveria geras perspektyvas jį naudoti ateityje.
Visus eksperimentus patvirtino Yeungnam universiteto Etikos komitetas, Kjonsanas, Korėja, o metodai buvo atlikti pagal Yeungnam universiteto Etikos komiteto gaires.
Kiaušinių inkubavimo eksperimentai buvo atlikti taikant nustatytas procedūras43. Norint įvertinti išsiritimo greitį (HR), 1 dienos senumo suaugę nematodai (maždaug 100 patelių ir 100 patinų) buvo perkelti į Petri lėkštes, kuriose buvo grybelis, ir leista augti 24 valandas. Tada kiaušiniai buvo izoliuoti ir apdoroti 5-jodoindolu (0, 05 mM ir 0, 1 mM) arba avermektinu (10 μg / ml) suspensija steriliame distiliuotame vandenyje. Šios suspensijos (500 μl; maždaug 100 kiaušinių) buvo perkeltos į 24 šulinėlių audinių kultūros plokštelės šulinius ir inkubuojamos 22 ° C temperatūroje. L2 skaičiavimai buvo atlikti po 24 valandų inkubacijos, tačiau buvo laikomi negyvais, jei ląstelės nejudėjo stimuliuojamos smulkia platinos viela. Šis eksperimentas buvo atliktas dviem etapais, kiekvienas su šešiais pakartojimais. Abiejų eksperimentų duomenys buvo sujungti ir pateikti. HR procentas apskaičiuojamas taip:
Lervų mirtingumas buvo įvertintas naudojant anksčiau sukurtas procedūras. Nematodų kiaušiniai buvo surinkti ir embrionai sinchronizuoti perinti steriliame distiliuotame vandenyje, kad būtų sukurtos L2 stadijos lervos. Sinchronizuotos lervos (apie 500 nematodų) buvo apdorotos 5-jodoindolu (0,05 mM ir 0,1 mM) arba avermektinu (10 μg/ml) ir auginamos B. cinerea Petri lėkštelėse. Po 48 valandų inkubacijos 22 ° C temperatūroje nematodai buvo surinkti į sterilų distiliuotą vandenį ir ištirti, ar nėra L2, L3 ir L4 stadijų. L3 ir L4 stadijų buvimas rodė lervos transformaciją, o L2 stadijos buvimas nerodė transformacijos. Vaizdai buvo gauti naudojant iRiS™ skaitmeninę ląstelių vaizdo gavimo sistemą. Šis eksperimentas buvo atliktas dviem etapais, kiekvienas su šešiais pakartojimais. Abiejų eksperimentų duomenys buvo sujungti ir pateikti.
5-jodoindolo ir avermektino toksiškumas sėkloms buvo įvertintas naudojant daigumo testus Murashige ir Skoog agaro lėkštelėse.62 B. oleracea ir R. raphanistrum sėklos pirmą dieną mirkomos steriliame distiliuotame vandenyje, plaunamos 1 ml 100 % natrio mililitre hipochloritas) 15 minučių ir penkis kartus plaunamas 1 ml sterilaus vandens. Tada sterilizuotos sėklos buvo suspaustos ant daiginimo agaro plokštelių, kuriose yra 0,86 g/l (0,2x) Murashige ir Skoog terpės ir 0,7% bakteriologinio agaro su 5-jodoindolu arba avermektinu arba be jo. Tada plokštelės buvo inkubuojamos 22 ° C temperatūroje, o vaizdai buvo paimti po 3 dienų inkubacijos. Šis eksperimentas buvo atliktas dviem etapais, kurių kiekvienas turėjo šešis pakartojimus.
Paskelbimo laikas: 2025-02-26