Pušinė nematoda yra karantininis migruojantis endoparazitas, žinomas kaip sukeliantis didelius ekonominius nuostolius pušynų ekosistemose. Šiame tyrime apžvelgiamas halogenintų indolių nematocidinis aktyvumas prieš pušinius nematodus ir jų veikimo mechanizmas. 5-jodoindolo ir avermektino (teigiama kontrolė) nematocidinis aktyvumas prieš pušinius nematodus buvo panašus ir didelis esant mažoms koncentracijoms (10 μg/ml). 5-jodoindolis sumažino vaisingumą, reprodukcinį aktyvumą, embrionų ir lervų mirtingumą bei lokomotorinį elgesį. Ligandų molekulinė sąveika su bestuburiams būdingais glutamato valdomais chlorido kanalų receptoriais patvirtina mintį, kad 5-jodoindolis, kaip ir avermektinas, tvirtai jungiasi prie receptoriaus aktyviosios vietos. 5-jodoindolis taip pat sukėlė įvairias fenotipines nematodų deformacijas, įskaitant nenormalų organų kolapsą/susitraukimą ir padidėjusią vakuolizaciją. Šie rezultatai rodo, kad vakuolės gali atlikti vaidmenį nematodų metilinimo sukeltame mirtyje. Svarbu tai, kad 5-jodoindolis nebuvo toksiškas abiem augalų rūšims (kopūstams ir ridikėliams). Taigi, šis tyrimas parodo, kad jodoindolo naudojimas aplinkos sąlygomis gali kontroliuoti pušies vytulio pažeidimus.
Pušinė medienos nematoda (Bursaphelenchus xylophilus) priklauso pušinių medienos nematodų (PWN) grupei – migruojantiems endoparazitiniams nematodams, kurie, kaip žinoma, daro didelę ekologinę žalą pušynų ekosistemoms1. Pušinės medienos nematodos sukeliama pušų vytulio liga (PWD) tampa rimta problema keliuose žemynuose, įskaitant Aziją ir Europą, o Šiaurės Amerikoje nematoda naikina introdukuotas pušų rūšis1,2. Pušų nykimas yra didelė ekonominė problema, o jos pasaulinio plitimo perspektyva kelia nerimą3. Dažniausiai nematoda puola šias pušų rūšis: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii ir Pinus radiata4. Pušinė nematoda yra rimta liga, galinti sunaikinti pušis per kelias savaites ar mėnesius nuo užsikrėtimo. Be to, pušinių nematodų protrūkiai yra dažni įvairiose ekosistemose, todėl susidarė nuolatinės infekcijos grandinės1.
Bursaphelenchus xylophilus yra karantininė augalų parazitinė nematoda, priklausanti Aphelenchoidea antšeimiui ir 102.5 kladai. Nematoda minta grybais ir dauginasi pušų medienos audiniuose, vystydamasi į keturias skirtingas lervų stadijas: L1, L2, L3, L4 ir suaugusį individą1,6. Maisto trūkumo sąlygomis pušinė nematoda pereina į specializuotą lervų stadiją – dauer, kuri parazituoja ant savo vektoriaus – pušinio žievėgraužio (Monochamus alternatus) ir pernešama ant sveikų pušių. Sveikų šeimininkų organizme nematodos greitai migruoja per augalų audinius ir minta parenchiminėmis ląstelėmis, o tai sukelia daugybę padidėjusio jautrumo reakcijų, pušų vytimą ir žūtį per metus po užsikrėtimo1,7,8.
Biologinė pušinių nematodų kontrolė jau seniai yra iššūkis, o karantino priemonės taikomos dar XX amžiuje. Dabartinės pušinių nematodų kontrolės strategijos daugiausia apima cheminį apdorojimą, įskaitant medienos fumigaciją ir nematocidų implantavimą į medžių kamienus. Dažniausiai naudojami nematocidai yra avermektinas ir avermektino benzoatas, priklausantys avermektinų šeimai. Šios brangios cheminės medžiagos yra labai veiksmingos prieš daugelį nematodų rūšių ir laikomos saugiomis aplinkai9. Tačiau tikimasi, kad pakartotinis šių nematocidų naudojimas sukels atrankos spaudimą, kuris beveik neabejotinai sukels atsparių pušinių nematodų atsiradimą, kaip buvo įrodyta kelių vabzdžių kenkėjų, tokių kaip Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella ir nematodų Trichostrongylus colubriformis bei Ostertagia circumcincta, kurie palaipsniui įgijo atsparumą avermektinams10,11,12, atveju. Todėl atsparumo modeliai turi būti reguliariai tiriami, o nematocidai nuolat tikrinami, siekiant rasti alternatyvias, ekonomiškas ir aplinkai nekenksmingas PVD kontrolės priemones. Pastaraisiais dešimtmečiais nemažai autorių siūlė naudoti augalų ekstraktus, eterinius aliejus ir lakiąsias medžiagas kaip nematodų kontrolės priemones13,14,15,16.
Neseniai pademonstravome indolo, tarpląstelinės ir tarpkaralystės signalizacijos molekulės, nematicidinį aktyvumą Caenorhabditis elegans 17. Indolis yra plačiai paplitęs tarpląstelinis signalas mikrobų ekologijoje, kontroliuojantis daugybę funkcijų, turinčių įtakos mikrobų fiziologijai, sporų formavimuisi, plazmidžių stabilumui, atsparumui vaistams, bioplėvelės formavimuisi ir virulentiškumui 18, 19. Indolo ir jo darinių aktyvumas prieš kitus patogeninius nematodus nebuvo tirtas. Šiame tyrime ištyrėme 34 indolių nematicidinį aktyvumą prieš pušinius nematodus ir išsiaiškinome stipriausio 5-jodoindolo veikimo mechanizmą, naudodami mikroskopiją, pagreitintą fotografiją ir molekulinio dokavimo eksperimentus, bei įvertinome jo toksinį poveikį augalams, naudodami sėklų daigumo tyrimą.
Anksčiau buvo pranešta, kad didelės (> 1,0 mM) indolo koncentracijos turi nematocidinį poveikį nematodams17. Po B. xylophilus (mišrių gyvenimo stadijų) apdorojimo indolu arba 33 skirtingais indolo dariniais, kurių koncentracija yra 1 mM, B. xylophilus mirtingumas buvo matuojamas suskaičiuojant gyvas ir negyvas nematodas kontrolinėje ir apdorotoje grupėse. Penki indoliai pasižymėjo reikšmingu nematocidiniu aktyvumu; neapdorotos kontrolinės grupės išgyvenamumas po 24 val. buvo 95 ± 7%. Iš 34 tirtų indolių 5-jodoindolis ir 4-fluoroindolis, kurių koncentracija yra 1 mM, sukėlė 100 % mirtingumą, o 5,6-difluoroindigas, metilindol-7-karboksilatas ir 7-jodoindolis sukėlė maždaug 50 % mirtingumą (1 lentelė).
5-jodinoidolo poveikis pušinių nematodų vakuolių susidarymui ir metabolizmui. (A) Avermektino ir 5-jodinoidolo poveikis suaugusiems patinų nematodams, (B) L1 stadijos nematodų kiaušinėliai ir (C) B. xylophilus metabolizmas, (i) vakuolės nebuvo stebimos 0 val., gydymas sukėlė (ii) vakuoles, (iii) daugybinių vakuolių susikaupimą, (iv) vakuolių patinimą, (v) vakuolių susiliejimą ir (vi) milžiniškų vakuolių susidarymą. Raudonos rodyklės rodo vakuolių patinimą, mėlynos rodyklės rodo vakuolių susiliejimą, o juodos rodyklės rodo milžiniškas vakuoles. Mastelio juosta = 50 μm.
Be to, šiame tyrime taip pat aprašytas nuoseklus metano sukeltos pušinių nematodų mirties procesas (4C pav.). Metanogeninė mirtis yra neapoptozinis ląstelių mirties tipas, susijęs su ryškių citoplazminių vakuolių kaupimusi27. Pušinių nematodų morfologiniai defektai, atrodo, yra glaudžiai susiję su metano sukeltos mirties mechanizmu. Mikroskopinis tyrimas skirtingu metu parodė, kad po 20 val. poveikio 5-jodindolui (0,1 mM) susidarė milžiniškos vakuolės. Po 8 val. apdorojimo buvo pastebėtos mikroskopinės vakuolės, o jų skaičius padidėjo po 12 val. Po 14 val. buvo pastebėtos kelios didelės vakuolės. Po 12–16 val. apdorojimo buvo aiškiai matomos kelios susiliejusios vakuolės, o tai rodo, kad vakuolių susiliejimas yra metanogeninės mirties mechanizmo pagrindas. Po 20 valandų visame slieke buvo rasta keletas milžiniškų vakuolių. Šie stebėjimai yra pirmasis pranešimas apie metoozę C. elegans.
5-jodinoliu paveiktuose sliekuose taip pat pastebėta vakuolių agregacija ir plyšimas (5 pav.), ką rodo sliekų lenkimasis ir vakuolių išsiskyrimas į aplinką. Vakuolių ardymas taip pat pastebėtas kiaušinio lukšto membranoje, kurią išsiritimo metu L2 paprastai išsaugo nepažeistą (papildomas S2 pav.). Šie stebėjimai patvirtina skysčių kaupimosi ir osmoreguliacijos sutrikimo, taip pat grįžtamojo ląstelių pažeidimo (RCI) dalyvavimą vakuolių susidarymo ir pūliavimo procese (5 pav.).
Iškeldami hipotezę apie jodo vaidmenį stebimame vakuolių formavimesi, ištyrėme natrio jodido (NaI) ir kalio jodido (KI) nematicidinį aktyvumą. Tačiau esant koncentracijoms (0,1, 0,5 arba 1 mM), jie neturėjo įtakos nei nematodų išgyvenimui, nei vakuolių formavimuisi (papildomas S5 pav.), nors 1 mM KI turėjo nedidelį nematicidinį poveikį. Kita vertus, 7-jodoindolas (1 arba 2 mM), kaip ir 5-jodoindolas, sukėlė daugybines vakuoles ir struktūrines deformacijas (papildomas S6 pav.). Abu jodoindoliai pasižymėjo panašiomis fenotipinėmis savybėmis pušų nematoduose, o NaI ir KI – ne. Įdomu tai, kad indolas nesukėlė vakuolių susidarymo B. xylophilus esant išbandytoms koncentracijoms (duomenys nepateikti). Taigi, rezultatai patvirtino, kad indolo-jodo kompleksas yra atsakingas už B. xylophilus vakuolizaciją ir metabolizmą.
Iš indolių, tirtų dėl nematicidinio aktyvumo, 5-jodoindolis pasižymėjo didžiausiu slydimo indeksu – -5,89 kcal/mol, po jo sekė 7-jodoindolis (-4,48 kcal/mol), 4-fluoroindolis (-4,33) ir indolis (-4,03) (6 pav.). Stiprus 5-jodoindolo vandenilinis ryšys su leucinu 218 stabilizuoja jo prisijungimą, tuo tarpu visi kiti indolo dariniai prie serino 260 jungiasi per šoninės grandinės vandenilinius ryšius. Iš kitų sumodeliuotų jodoindolų, 2-jodoindolo prisijungimo vertė yra -5,248 kcal/mol, o tai lemia jo pagrindinis vandenilinis ryšys su leucinu 218. Kiti žinomi prisijungimai yra 3-jodoindolis (-4,3 kcal/mol), 4-jodoindolis (-4,0 kcal/mol) ir 6-fluoroindolis (-2,6 kcal/mol) (papildomas S8 pav.). Dauguma halogenintų indolių ir pats indolas, išskyrus 5-jodindolą ir 2-jodindolą, sudaro ryšį su serinu 260. Tai, kad vandenilinis ryšys su leucinu 218 rodo efektyvų receptoriaus ir ligando prisijungimą, kaip pastebėta ivermektino atveju (papildomas S7 pav.), patvirtina, kad 5-jodindolas ir 2-jodindolas, kaip ir ivermektinas, tvirtai jungiasi prie aktyviosios GluCL receptoriaus vietos per leuciną 218 (6 pav. ir papildomas S8 pav.). Manome, kad šis prisijungimas yra būtinas norint išlaikyti atvirą GluCL komplekso porų struktūrą ir kad tvirtai prisijungdami prie aktyviosios GluCL receptoriaus vietos, 5-jodindolas, 2-jodindolas, avermektinas ir ivermektinas, tokiu būdu palaiko jonų kanalą atvirą ir leidžia skysčiui pasisavinti.
Indolo ir halogeninto indolo molekulinis prijungimas prie GluCL. (A) indolo, (B) 4-fluorindolo, (C) 7-jodino ir (D) 5-jodino ligandų prisijungimo prie GluCL aktyviosios srities orientacijos. Baltymas pavaizduotas juostele, o pagrindinės vandenilinės jungtys parodytos geltonomis punktyrinėmis linijomis. (A′), (B′), (C′) ir (D′) rodo atitinkamų ligandų sąveiką su aplinkinėmis aminorūgščių liekanomis, o šoninės grandinės vandenilinės jungtys parodytos rausvomis punktyrinėmis rodyklėmis.
Buvo atlikti eksperimentai, siekiant įvertinti 5-jodinolo toksinį poveikį kopūstų ir ridikėlių sėklų daigumui. 5-jodinolas (0,05 arba 0,1 mM) arba avermektinas (10 μg/ml) turėjo mažai arba visai neturėjo įtakos pradiniam dygimui ir augalėlių atsiradimui (7 pav.). Be to, reikšmingo skirtumo tarp neapdorotų kontrolinių ir 5-jodinolu arba avermektinu apdorotų sėklų dygimo greičio nerasta. Poveikis liemens šaknų pailgėjimui ir susiformavusių šoninių šaknų skaičiui buvo nereikšmingas, nors 1 mM (10 kartų didesnė už aktyviąją koncentraciją) 5-jodinolo šiek tiek sulėtino šoninių šaknų vystymąsi. Šie rezultatai rodo, kad 5-jodinolas nėra toksiškas augalų ląstelėms ir netrikdo augalų vystymosi procesų, esant tiriamoms koncentracijoms.
5-jodinolo poveikis sėklų dygimui. B. oleracea ir R. raphanistrum sėklų dygimas, dygimas ir šoninis įsišaknijimas Murashige ir Skoog agaro terpėje su avermektinu arba 5-jodinolu arba be jų. Dygimas buvo užfiksuotas po 3 dienų inkubacijos 22 °C temperatūroje.
Šiame tyrime aprašomi keli nematodų naikinimo atvejai indoliai. Svarbu tai, kad tai pirmasis pranešimas apie jodoindolo sukeltą pušų spyglių metilinimą (procesą, kurį sukelia mažų vakuolių kaupimasis, kurios palaipsniui susilieja į milžiniškas vakuoles, galiausiai sukeldamos membranos plyšimą ir žūtį), o jodoindolas pasižymi reikšmingomis nematocidinėmis savybėmis, panašiomis į komercinio nematocido avermektino.
Anksčiau buvo pranešta, kad indoliai prokariotuose ir eukariotuose atlieka daugybę signalizacijos funkcijų, įskaitant bioplėvelės slopinimą / formavimąsi, bakterijų išgyvenimą ir patogeniškumą19,32,33,34. Pastaruoju metu didelis mokslinių tyrimų susidomėjimas susilaukė potencialaus halogenintų indolių, indolių alkaloidų ir pusiau sintetinių indolių darinių terapinio poveikio35,36,37. Pavyzdžiui, įrodyta, kad halogeninti indoliai naikina patvarias Escherichia coli ir Staphylococcus aureus ląsteles37. Be to, moksliškai įdomu ištirti halogenintų indolių veiksmingumą prieš kitas rūšis, gentis ir karalystes, ir šis tyrimas yra žingsnis siekiant šio tikslo.
Čia siūlome 5-jodinolo sukelto mirtingumo C. elegans mechanizmą, pagrįstą grįžtamuoju ląstelių pažeidimu (RCI) ir metilinimu (4C ir 5 paveikslai). Edematiniai pokyčiai, tokie kaip patinimas ir vakuolų degeneracija, yra RCI ir metilinimo rodikliai, pasireiškiantys milžiniškomis vakuolėmis citoplazmoje48,49. RCI trukdo energijos gamybai, sumažindamas ATP gamybą, sukeldamas ATPazės siurblio gedimą arba sutrikdydamas ląstelių membranas ir sukeldamas greitą Na+, Ca2+ ir vandens antplūdį50,51,52. Intracitoplazminės vakuolės gyvūnų ląstelėse atsiranda dėl skysčių kaupimosi citoplazmoje dėl Ca2+ ir vandens antplūdžio53. Įdomu tai, kad šis ląstelių pažeidimo mechanizmas yra grįžtamas, jei pažeidimas yra laikinas ir ląstelės tam tikrą laiką pradeda gaminti ATP, tačiau jei pažeidimas išlieka arba pablogėja, ląstelės žūsta.54 Mūsų stebėjimai rodo, kad 5-jodinolu paveiktos nematodos negali atkurti normalios biosintezės po streso sąlygų.
5-jodinolo sukeltas metilinimo fenotipas B. xylophilus gali būti susijęs su jodo buvimu ir jo molekuliniu pasiskirstymu, nes 7-jodinolas slopino B. xylophilus mažiau nei 5-jodinolas (1 lentelė ir papildomas S6 paveikslas). Šie rezultatai iš dalies atitinka Maltese ir kt. (2014 m.) tyrimus, kuriuose pranešta, kad piridilo azoto dalies perkėlimas indole iš para- į meta-padėtį panaikino vakuolizaciją, augimo slopinimą ir citotoksiškumą U251 ląstelėse, o tai rodo, kad molekulės sąveika su specifine aktyvia baltymo vieta yra labai svarbi27,44,45. Šiame tyrime stebėta indolo arba halogenintų indolių ir GluCL receptorių sąveika taip pat patvirtina šią mintį, nes nustatyta, kad 5- ir 2-jodinolai prie GluCL receptorių jungiasi stipriau nei kiti tirti indoliai (6 paveikslas ir papildomas S8 paveikslas). Nustatyta, kad jodas, esantis antroje arba penktoje indolo padėtyje, jungiasi prie GluCL receptoriaus leucino 218 per vandenilinius ryšius, tuo tarpu kiti halogeninti indoliai ir pats indolas sudaro silpnus vandenilinius ryšius su serinu 260 šoninėse grandinėse (6 pav.). Todėl spėjame, kad halogeno lokalizacija vaidina svarbų vaidmenį vakuolių degeneracijos indukcijoje, o glaudus 5-jodinolo prisijungimas išlaiko jonų kanalą atvirą, taip sudarydamas sąlygas greitam skysčio patekimui ir vakuolių plyšimui. Tačiau išsamus 5-jodinolo veikimo mechanizmas dar nėra nustatytas.
Prieš pradedant praktinį 5-jodinolio naudojimą, reikėtų išanalizuoti jo toksinį poveikį augalams. Mūsų atlikti sėklų daiginimo eksperimentai parodė, kad tirtomis koncentracijomis 5-jodinolis neturėjo neigiamo poveikio sėklų dygimui ar vėlesniems vystymosi procesams (7 pav.). Taigi, šis tyrimas suteikia pagrindą 5-jodinolio naudojimui ekologinėje aplinkoje, siekiant kontroliuoti pušinių nematodų kenksmingumą pušims.
Ankstesnėse ataskaitose buvo įrodyta, kad indolių pagrindu taikoma terapija yra potencialus būdas spręsti atsparumo antibiotikams ir vėžio progresavimo problemą55. Be to, indoliai pasižymi antibakteriniu, priešvėžiniu, antioksidaciniu, priešuždegiminiu, antidiabetiniu, antivirusiniu, antiproliferaciniu ir antituberkulioziniu aktyvumu ir gali būti perspektyvus vaistų kūrimo pagrindas56,57. Šis tyrimas pirmą kartą siūlo galimybę jodą naudoti kaip antiparazitinę ir antihelmintinę priemonę.
Avermektinas buvo atrastas prieš tris dešimtmečius ir 2015 m. laimėjo Nobelio premiją, o jo, kaip antihelmintiko, naudojimas vis dar aktyviai vyksta. Tačiau dėl spartaus nematodų ir vabzdžių kenkėjų atsparumo avermektinams vystymosi reikalinga alternatyvi, nebrangi ir aplinkai nekenksminga strategija, skirta kontroliuoti pušų PSN infekciją. Šiame tyrime taip pat aprašomas mechanizmas, kuriuo 5-jodoindolas naikina pušų nematodus, ir tai, kad 5-jodoindolas yra mažai toksiškas augalų ląstelėms, o tai atveria geras perspektyvas jo komerciniam pritaikymui ateityje.
Visus eksperimentus patvirtino Yeungnam universiteto, Gyeongsano, Korėjos, etikos komitetas, o metodai buvo atlikti laikantis Yeungnam universiteto etikos komiteto gairių.
Kiaušinių inkubavimo eksperimentai buvo atlikti naudojant nustatytas procedūras43. Norint įvertinti išsiritimo greitį (HR), 1 dienos amžiaus suaugusios nematodos (maždaug 100 patelių ir 100 patinų) buvo perkeltos į Petri lėkšteles su grybeliu ir leista augti 24 valandas. Tada kiaušinėliai buvo izoliuoti ir apdoroti 5-jodindoliu (0,05 mM ir 0,1 mM) arba avermektinu (10 μg/ml) kaip suspensija steriliame distiliuotame vandenyje. Šios suspensijos (500 μl; maždaug 100 kiaušinėlių) buvo perkeltos į 24 šulinėlių audinių kultūros plokštelės šulinėlius ir inkubuojamos 22 °C temperatūroje. L2 skaičiavimas buvo atliktas po 24 valandų inkubacijos, tačiau buvo laikomos negyvomis, jei ląstelės nejudėjo, stimuliuojamos plona platinos viela. Šis eksperimentas buvo atliktas dviem etapais, kiekvienas iš jų buvo kartojamas šešis kartus. Abiejų eksperimentų duomenys buvo sujungti ir pateikti. HR procentinė dalis apskaičiuojama taip:
Lervų mirtingumas buvo įvertintas naudojant anksčiau sukurtas procedūras. Nematodų kiaušinėliai buvo surinkti, o embrionai sinchronizuoti išsiritant steriliame distiliuotame vandenyje, kad būtų sukurtos L2 stadijos lervos. Sinchronizuotos lervos (maždaug 500 nematodų) buvo apdorotos 5-jodindoliu (0,05 mM ir 0,1 mM) arba avermektinu (10 μg/ml) ir auginamos ant B. cinerea Petri lėkštelių. Po 48 valandų inkubacijos 22 °C temperatūroje nematodai buvo surinkti steriliame distiliuotame vandenyje ir ištirti, ar yra L2, L3 ir L4 stadijų. L3 ir L4 stadijų buvimas rodė lervų transformaciją, o L2 stadijos buvimas nerodė transformacijos. Vaizdai buvo gauti naudojant „iRiS™ Digital Cell Imaging System“. Šis eksperimentas buvo atliktas dviem etapais, kiekvienas iš jų buvo kartojamas šešis kartus. Abiejų eksperimentų duomenys buvo sujungti ir pateikti.
5-jodinolo ir avermektino toksiškumas sėkloms buvo įvertintas atliekant daigumo testus Murashige ir Skoog agaro lėkštelėse.62 B. oleracea ir R. raphanistrum sėklos pirmiausia buvo vieną dieną mirkomos steriliame distiliuotame vandenyje, plaunamos 1 ml 100 % etanolio, 15 min. sterilizuojamos 1 ml 50 % komercinio baliklio (3 % natrio hipochlorito) ir penkis kartus plaunamos 1 ml sterilaus vandens. Sterilizuotos sėklos buvo supresuotos ant daiginimo agaro lėkštelių, kuriose buvo 0,86 g/l (0,2X) Murashige ir Skoog terpės ir 0,7 % bakteriologinio agaro su 5-jodinolu arba avermektinu arba be jų. Tada lėkštelės buvo inkubuojamos 22 °C temperatūroje, o vaizdai buvo fotografuojami po 3 dienų inkubacijos. Šis eksperimentas buvo atliktas dviem etapais, kiekvienas iš jų buvo kartojamas šešis kartus.
Įrašo laikas: 2025 m. vasario 26 d.