Dėkojame, kad apsilankėte Nature.com. Jūsų naudojama naršyklės versija turi ribotą CSS palaikymą. Geriausiems rezultatams pasiekti rekomenduojame naudoti naujesnę naršyklės versiją (arba išjungti suderinamumo režimą „Internet Explorer“). Tuo tarpu, siekdami užtikrinti nuolatinį palaikymą, svetainę rodome be stiliaus ar „JavaScript“.
Fungicidai dažnai naudojami medžių žydėjimo metu ir gali kelti grėsmę vabzdžiams apdulkintojams. Tačiau mažai žinoma apie tai, kaip ne bitės apdulkintojai (pvz., pavienės bitės, Osmia cornifrons) reaguoja į kontaktinius ir sisteminius fungicidus, dažniausiai naudojamus obelims žydėjimo metu. Šis žinių trūkumas riboja reguliavimo sprendimus, nustatant saugias fungicidų purškimo koncentracijas ir laiką. Įvertinome dviejų kontaktinių fungicidų (kaptano ir mankozebo) ir keturių tarpsluoksninių/fitosistemų fungicidų (ciprociklino, miklobutanilo, pirostrobino ir trifloksistrobino) poveikį. Poveikis lervų svorio prieaugiui, išgyvenamumui, lyčių santykiui ir bakterijų įvairovei. Vertinimas buvo atliktas naudojant lėtinį geriamąjį biologinį tyrimą, kuriame žiedadulkės buvo apdorojamos trimis dozėmis, remiantis šiuo metu rekomenduojama lauko naudojimo doze (1X), puse dozės (0,5X) ir maža doze (0,1X). Visos mankozebo ir piritizolino dozės reikšmingai sumažino kūno svorį ir lervų išgyvenamumą. Tada sekvenavome 16S geną, kad apibūdintume mankozebo, fungicido, atsakingo už didžiausią mirtingumą, lervų bakteriomą. Nustatėme, kad lervų, mintančių mankozebu apdorotomis žiedadulkėmis, bakterijų įvairovė ir gausa buvo žymiai sumažėjusi. Mūsų laboratoriniai rezultatai rodo, kad kai kurių iš šių fungicidų purškimas žydėjimo metu yra ypač kenksmingas O. cornifrons sveikatai. Ši informacija yra svarbi priimant būsimus valdymo sprendimus dėl tvaraus vaismedžių apsaugos produktų naudojimo ir yra pagrindas reguliavimo procesams, skirtiems apdulkintojų apsaugai.
Vienišė mūrinė bitė Osmia cornifrons (Hymenoptera: Megachilidae) buvo introdukuota į Jungtines Valstijas iš Japonijos aštuntojo dešimtmečio pabaigoje ir devintojo dešimtmečio pradžioje, ir nuo to laiko ši rūšis atlieka svarbų apdulkintojo vaidmenį valdomose ekosistemose. Natūralizuotos šios bitės populiacijos priklauso maždaug 50 laukinių bičių rūšių, kurios papildo bites, apdulkinančias migdolų ir obelų sodus Jungtinėse Valstijose2,3. Mūrinės bitės susiduria su daugybe iššūkių, įskaitant buveinių fragmentaciją, patogenus ir pesticidus3,4. Iš insekticidų fungicidai mažina energijos gavimą, maisto paieškas5 ir kūno kondicionavimą6,7. Nors naujausi tyrimai rodo, kad mūrinių bičių sveikatą tiesiogiai veikia komensaliniai ir ektobakteriniai mikroorganizmai8,9, nes bakterijos ir grybeliai gali paveikti mitybą ir imuninį atsaką, fungicidų poveikio mūrinių bičių mikrobų įvairovei tyrimas tik pradedamas.
Įvairaus poveikio (kontaktinio ir sisteminio) fungicidai purškiami soduose prieš žydėjimą ir jo metu, siekiant gydyti tokias ligas kaip obelų rauplės, kartusis puvinys, rudasis puvinys ir miltligė10,11. Fungicidai laikomi nekenksmingais apdulkintojams, todėl juos rekomenduojame sodininkams žydėjimo laikotarpiu; Bičių sąlytis su šiais fungicidais ir jų vartojimas yra gana gerai žinomas, nes tai yra JAV Aplinkos apsaugos agentūros ir daugelio kitų nacionalinių reguliavimo agentūrų pesticidų registracijos proceso dalis12,13,14. Tačiau fungicidų poveikis ne bitėms yra mažiau žinomas, nes jų nereikalaujama pagal rinkodaros leidimo sutartis Jungtinėse Valstijose15. Be to, paprastai nėra standartizuotų protokolų pavienėms bitėms tirti16,17, o bičių kolonijų, kurios teikia bites tyrimams, išlaikymas yra sudėtingas18. Europoje ir JAV vis dažniau atliekami skirtingų bičių bandymai, siekiant ištirti pesticidų poveikį laukinėms bitėms, o neseniai buvo sukurti standartizuoti protokolai O. cornifrons19.
Raguotos bitės yra monocitai ir komerciškai naudojamos karpių pasėliuose kaip medunešių bičių papildas arba pakaitalas. Šios bitės išsirita kovo–balandžio mėnesiais, o anksti subrendę patinai išsirita tris–keturias dienas anksčiau nei patelės. Po poravimosi patelė aktyviai renka žiedadulkes ir nektarą, kad vamzdinėje lizdo ertmėje (natūralioje arba dirbtinėje) susidarytų perų ląstelių serija1,20. Kiaušiniai dedami ant žiedadulkių ląstelių viduje; tada patelė pastato molinę sienelę prieš paruošdama kitą ląstelę. Pirmosios stadijos lervos yra uždaromos chorione ir minta embriono skysčiais. Nuo antrosios iki penktosios stadijos (priešlėliukės) lervos minta žiedadulkėmis22. Kai žiedadulkių atsargos visiškai išeikvojamos, lervos suformuoja kokonus, virsta lėliukėmis ir išsirita kaip suaugusios individės toje pačioje perų kameroje, paprastai vasaros pabaigoje20,23. Suaugusios individės išsirita kitą pavasarį. Suaugusių individų išgyvenamumas yra susijęs su grynuoju energijos prieaugiu (svorio prieaugiu), pagrįstu maisto suvartojimu. Taigi, žiedadulkių maistinė kokybė, taip pat kiti veiksniai, tokie kaip oras ar pesticidų poveikis, yra išgyvenimo ir sveikatos veiksniai24.
Prieš žydėjimą naudojami insekticidai ir fungicidai augalo kraujagyslių sistemoje gali judėti įvairiu laipsniu – nuo translaminarinio (pvz., galinčio judėti iš viršutinio lapų paviršiaus į apatinį, kaip kai kurie fungicidai)25 iki tikrai sisteminio poveikio. Pesticidai, kurie gali prasiskverbti pro vainiką nuo šaknų, gali patekti į obelų žiedų nektarą26, kur gali sunaikinti suaugusius O. cornifrons27. Kai kurie pesticidai taip pat išsiplauna į žiedadulkes, paveikdami kukurūzų lervų vystymąsi ir sukeldami jų žūtį19. Kiti tyrimai parodė, kad kai kurie fungicidai gali reikšmingai pakeisti giminingos rūšies O. lignaria28 lizdaviečių sukimo elgseną. Be to, laboratoriniai ir lauko tyrimai, imituojantys pesticidų (įskaitant fungicidus) poveikio scenarijus, parodė, kad pesticidai neigiamai veikia medunešių bičių ir kai kurių pavienių bičių fiziologiją22, morfologiją29 ir išgyvenimą. Įvairūs fungicidiniai purškalai, tiesiogiai purškiami ant atvirų žiedų žydėjimo metu, gali užteršti suaugusių bičių lervų vystymuisi surinktas žiedadulkes, kurių poveikis dar turi būti ištirtas30.
Vis labiau pripažįstama, kad lervų vystymuisi įtakos turi žiedadulkės ir virškinimo sistemos mikrobų bendrijos. Bičių mikrobiomas daro įtaką tokiems parametrams kaip kūno masė31, medžiagų apykaitos pokyčiai22 ir jautrumas patogenams32. Ankstesni tyrimai nagrinėjo vystymosi stadijos, maistinių medžiagų ir aplinkos įtaką pavienių bičių mikrobiomui. Šie tyrimai atskleidė lervų ir žiedadulkių mikrobiomų struktūros ir gausos panašumus33, taip pat dažniausiai pasitaikančias bakterijų gentis Pseudomonas ir Delftia tarp pavienių bičių rūšių. Tačiau, nors fungicidai buvo siejami su bičių sveikatos apsaugos strategijomis, fungicidų poveikis lervų mikrobiotai per tiesioginį oralinį sąlytį vis dar nėra ištirtas.
Šiame tyrime buvo tirtas šešių dažniausiai naudojamų fungicidų, Jungtinėse Valstijose registruotų naudoti vaismedžiams, įskaitant kontaktinius ir sisteminius fungicidus, skiriamus per burną kukurūzinių raguolių kandžių lervoms iš užteršto maisto, poveikis realiomis dozėmis. Nustatėme, kad kontaktiniai ir sisteminiai fungicidai sumažino bičių kūno svorio prieaugį ir padidino mirtingumą, o sunkiausias poveikis buvo susijęs su mankozebu ir piritiopidu. Tada palyginome lervų, šeriamų mankozebu apdorotu žiedadulkių pašaru, ir lervų, šeriamų kontroliniu pašaru, mikrobų įvairovę. Aptarėme galimus mirtingumo mechanizmus ir jų poveikį integruotos kenkėjų ir apdulkintojų kontrolės (IPPM)36 programoms.
Suaugę O. cornifrons kokonuose žiemojantys pavidalai buvo gauti iš Vaisių tyrimų centro Biglervilyje, Pensilvanijos valstijoje, ir laikomi –3–2 °C temperatūroje (±0,3 °C). Prieš eksperimentą (iš viso 600 kokonų). 2022 m. gegužės mėn. 100 O. cornifrons kokonų kasdien buvo perkeliami į plastikinius puodelius (50 kokonų viename puodelyje, DI 5 cm × 15 cm ilgio), o į puodelių vidų buvo dedamos servetėlės, kad jie lengviau atsidarytų ir būtų kramtomas substratas, sumažinantis akmeninių bičių stresą37. Du plastikinius puodelius su kokonais įdėkite į vabzdžių narvelį (30 × 30 × 30 cm, „BugDorm MegaView Science Co. Ltd.“, Taivanas) su 10 ml lesyklėlėmis, kuriose yra 50 % sacharozės tirpalo, ir laikykite keturias dienas, kad užtikrintų užsidarymą ir poravimąsi. 23 °C, santykinė oro drėgmė 60 %, fotoperiodas 10 l (mažas intensyvumas): 14 dienų. 100 poruotų patelių ir patinų buvo paleidžiami kiekvieną rytą šešias dienas (po 100 per dieną) į du dirbtinius lizdus per didžiausią obelų žydėjimą (spąstų lizdas: plotis 33, 66 × aukštis 30, 48 × ilgis 46, 99 cm; papildomas 1 paveikslas). Pastatyta Pensilvanijos valstijos medelyne, šalia vyšnių (Prunus cerasus 'Eubank' Sweet Cherry Pie™), persikų (Prunus persica 'Contender'), Prunus persica 'PF 27A' Flamin Fury®), kriaušių (Pyrus perifolia 'Olympic', Pyrus perifolia 'Shinko', Pyrus perifolia 'Shinseiki'), vainikinių obelų (Malus coronaria) ir daugybės kitų obelų veislių (Malus coronaria, Malus), naminių obelų 'Co-op 30′ Enterprise™, Malus apple tree 'Co-Op 31′ Winecrisp™, begonijų 'Freedom', begonijų 'Golden Delicious', begonijų 'Nova Spy'). Kiekvienas mėlynas plastikinis paukščių namelis telpa ant dviejų medinių dėžių. Kiekviename lizde buvo 800 tuščių kraftpopierinių vamzdelių (spiralės formos, 0,8 cm vidinis skersmuo × 15 cm) („Jonesville Paper Tube Co.“, Mičiganas), įkištų į nepermatomus celofaninius vamzdelius (0,7 išorinis skersmuo, žr. Plastikiniai kamščiai (T-1X kamščiai) suteikia lizdaviečių vietas.
Abu inkilai buvo nukreipti į rytus ir buvo uždengti žalia plastikine sodo tvora („Everbilt“ modelis Nr. 889250EB12, angos dydis 5 × 5 cm, 0,95 m × 100 m), kad graužikai ir paukščiai nepatektų, ir padėti ant dirvos paviršiaus šalia inkilų dirvožemio dėžučių. Inkilas (papildomas 1a paveikslas). Kukurūzinių gręžtuvų kiaušinėliai buvo renkami kasdien, surenkant 30 mėgintuvėlių iš lizdų ir gabenant juos į laboratoriją. Žirklėmis įpjaukite mėgintuvėlio galą, tada išardykite spiralinį vamzdelį, kad atidengtumėte perų ląsteles. Atskiri kiaušinėliai ir jų žiedadulkės buvo pašalinami naudojant lenktą mentelę („Microslide“ įrankių rinkinys, „BioQuip Products Inc.“, Kalifornija). Kiaušiniai buvo inkubuojami ant drėgno filtravimo popieriaus ir 2 valandoms dedami į Petri lėkštelę, prieš naudojant mūsų eksperimentuose (papildomas 1b–d paveikslas).
Laboratorijoje įvertinome šešių fungicidų, panaudotų prieš obelų žydėjimą ir jo metu, oralinį toksiškumą, esant trims koncentracijoms (0,1X, 0,5X ir 1X, kur 1X yra žymėjimas, panaudotas 100 galonų vandens/akrui. Didelė lauko dozė = koncentracija lauke). , 1 lentelė). Kiekviena koncentracija buvo pakartota 16 kartų (n = 16). Du kontaktiniai fungicidai (S1 lentelė: mankozebas 2696,14 ppm ir kaptanas 2875,88 ppm) ir keturi sisteminiai fungicidai (S1 lentelė: piritiostrobinas 250,14 ppm; trifloksistrobinas 110,06 ppm; miklobutanilo azolas 75,12 ppm; ciprodinilas 280,845 ppm) parodė toksiškumą vaisiams, daržovėms ir dekoratyviniams augalams. Žiedadulkes homogenizavome malūnėliu, 0,20 g perkėlėme į šulinėlį (24 šulinėlių „Falcon“ plokštelė) ir įpylėme bei sumaišėme 1 μl fungicido tirpalo, kad susidarytų piramidės formos žiedadulkės su 1 mm gylio šulinėliais, į kuriuos buvo sudėti kiaušinėliai. Įdėkite naudodami mini mentelę (papildomas 1c, d paveikslai). „Falcon“ plokštelės buvo laikomos kambario temperatūroje (25 °C) ir 70 % santykinėje drėgmėje. Jas palyginome su kontrolinėmis lervomis, šeriamomis homogeniniu žiedadulkių pašaru, apdorojamu grynu vandeniu. Mirtingumą registravome ir lervų svorį matavome kas antrą dieną, kol lervos pasiekė lėliukės amžių, naudodami analitines svarstykles („Fisher Scientific“, tikslumas = 0,0001 g). Galiausiai, lyčių santykis buvo įvertintas atidarius kokoną po 2,5 mėnesio.
DNR buvo išskirta iš sveikų O. cornifrons lervų (n = 3 kiekvienam apdorojimo režimui, mankozebu apdorotos ir neapdorotos žiedadulkės) ir atlikome šių mėginių mikrobų įvairovės analizę, ypač todėl, kad mankozebo atveju didžiausias mirtingumas buvo pastebėtas lervose, gavusiose MnZn. DNR buvo amplifikuota, išgryninta naudojant DNAZymoBIOMICS®-96 MagBead DNR rinkinį („Zymo Research“, Irvine, Kalifornija) ir sekvenuota (600 ciklų) naudojant Illumina® MiSeq™ su v3 rinkiniu. Tikslinė bakterijų 16S ribosominės RNR genų sekvenavimas buvo atliktas naudojant Quick-16S™ NGS bibliotekos paruošimo rinkinį („Zymo Research“, Irvine, Kalifornija), naudojant pradmenis, nukreiptus į 16S rRNR geno V3-V4 regioną. Be to, 18S sekvenavimas buvo atliktas naudojant 10 % PhiX įtraukimą, o amplifikacija buvo atlikta naudojant pradmenų porą 18S001 ir NS4.
Importuokite ir apdorokite suporuotus nuskaitymus39 naudodami QIIME2 srautą (v2022.11.1). Šie nuskaitymai buvo apkarpyti ir sujungti, o chimerinės sekos pašalintos naudojant DADA2 papildinį QIIME2 (qiime dada2 triukšmo poravimas)40. 16S ir 18S klasių priskyrimai buvo atlikti naudojant objektų klasifikatoriaus papildinį „Classify-sklearn“ ir iš anksto apmokytą artefaktą „silva-138-99-nb-classifier“.
Visi eksperimentiniai duomenys buvo patikrinti dėl normalumo (Shapiro-Wilkso testas) ir dispersijų homogeniškumo (Levene'o testas). Kadangi duomenų rinkinys neatitiko parametrinės analizės prielaidų, o transformacija nestandartizavo liekanų, atlikome neparametrinę dvikryptę ANOVA analizę (Kruskal-Wallis) su dviem veiksniais [laikas (trijų fazių 2, 5 ir 8 dienų laiko taškai) ir fungicidas], kad įvertintume apdorojimo poveikį lervų šviežiajai svoriui, o tada atlikome post hoc neparametrinius porinius palyginimus naudodami Wilcoxon testą. Fungicidų poveikiui išgyvenamumui palyginti esant trims fungicidų koncentracijoms naudojome apibendrintą tiesinį modelį (GLM) su Puasono skirstiniu41,42. Diferencinio gausumo analizei amplikonų sekos variantų (ASV) skaičius buvo suskleistas genties lygmeniu. Grupių diferencinio gausumo palyginimas naudojant 16S (genties lygmuo) ir 18S santykinį gausumą buvo atliktas naudojant apibendrintą adityvinį pozicijos, mastelio ir formos modelį (GAMLSS) su beta nulinės pripūtimo (BEZI) šeimų pasiskirstymu, kurie buvo modeliuojami makrokomandoje „Microbiome R43“ (v1.1). 1). Prieš diferencinę analizę pašalinkite mitochondrijų ir chloroplastų rūšis. Dėl skirtingų 18S taksonominių lygių diferencinei analizei buvo naudojamas tik žemiausias kiekvieno taksono lygis. Visos statistinės analizės buvo atliktos naudojant R (v. 3.4.3., CRAN projektas) (Komanda, 2013).
Mankozebo, piritiostrobino ir trifloksistrobino poveikis reikšmingai sumažino O. cornifrons kūno svorio prieaugį (1 pav.). Šis poveikis buvo nuosekliai stebimas taikant visas tris tirtas dozes (1a–c pav.). Ciklostrobinas ir miklobutanilis reikšmingai nesumažino lervų svorio.
Vidutinis šviežias stiebgręžių lervų svoris, išmatuotas trimis laiko momentais, taikant keturis pašarų apdorojimo būdus (homogeninis žiedadulkių pašaras + fungicidas: kontrolė, 0,1X, 0,5X ir 1X dozės). (a) Maža dozė (0,1X): pirmas laiko momentas (1 diena): χ2: 30,99, DF = 6; P < 0,0001, antras laiko momentas (5 diena): 22,83, DF = 0,0009; trečias kartas; taškas (8 diena): χ2: 28,39, DF = 6; (b) pusė dozės (0,5X): pirmas laiko momentas (1 diena): χ2: 35,67, DF = 6; P < 0,0001, antras laiko momentas (pirma diena). ): χ2: 15,98, DF = 6; P = 0,0090; trečias laiko taškas (8 diena) χ2: 16,47, DF = 6; (c) Vieta arba visa dozė (1X): pirmas laiko taškas (1 diena) χ2: 20,64, P = 6; P = 0,0326, antras laiko taškas (5 diena): χ2: 22,83, DF = 6; P = 0,0009; trečias laiko taškas (8 diena): χ2: 28,39, DF = 6; neparametrinė dispersinė analizė. Stulpeliai rodo porinių palyginimų vidurkį ± SE (α = 0,05) (n = 16) *P ≤ 0,05, **P ≤ 0,001, ***P ≤ 0,0001.
Mažiausia dozė (0,1X) sumažino lervų kūno svorį 60 % vartojant trifloksistrobiną, 49 % – mankozebą, 48 % – miklobutanilą ir 46 % – piritistrobiną (1a pav.). Veikiant puse lauko dozės (0,5X), mankozebo lervų kūno svoris sumažėjo 86 %, piritiostrobino – 52 %, o trifloksistrobino – 50 % (1b pav.). Visa lauko dozė (1X) mankozebo sumažino lervų svorį 82 %, piritiostrobino – 70 %, o trifloksistrobino, miklobutanilo ir sangardo – maždaug 30 % (1c pav.).
Mirtingumas buvo didžiausias tarp lervų, šeriamų mankozebu apdorotomis žiedadulkėmis, po jo sekė piritiostrobinas ir trifloksistrobinas. Mirtingumas didėjo didėjant mankozebo ir piritisolino dozėms (2 pav.; 2 lentelė). Tačiau kukurūzų gręžinių mirtingumas padidėjo tik nežymiai, didėjant trifloksistrobino koncentracijai; ciprodinilas ir kaptanas reikšmingai nepadidino mirtingumo, palyginti su kontroline grupe.
Buvo lyginamas musių lervų mirtingumas prarijus žiedadulkes, individualiai apdorotas šešiais skirtingais fungicidais. Mankozebas ir pentopiramidas buvo jautresni peroraliniam kukurūzų lervų sąlyčiui (GLM: χ = 29,45, DF = 20, P = 0,0059) (tiesė, nuolydis = 0,29, P < 0,001; nuolydis = 0,24, P < 0,00)).
Vidutiniškai, vertinant pagal visus gydymo būdus, 39,05 % pacientų buvo moterys ir 60,95 % – vyrai. Kontrolinės grupės pacientų dalis buvo 40 % tiek mažos dozės (0,1 karto), tiek pusės dozės (0,5 karto) tyrimuose, o lauko dozės (1 karto) tyrimuose – 30 %. Esant 0,1 karto dozei, tarp žiedadulkėmis maitintų lervų, gydytų mankozebu ir miklobutanilu, 33,33 % suaugusių lervų buvo patelės, 22 % suaugusių lervų buvo patelės, 44 % suaugusių lervų buvo patelės, 44 % suaugusių lervų buvo patelės. 41 % suaugusių lervų buvo patelės, o kontrolinės grupės – 31 % (3a pav.). Vartojant 0,5 karto didesnę dozę, 33 % suaugusių kirminų mankozebo ir piritiostrobino grupėje buvo patelės, 36 % trifloksistrobino grupėje, 41 % miklobutanilo grupėje ir 46 % ciprostrobino grupėje. Šis skaičius buvo 53 % kaptano grupėje ir 38 % kontrolinėje grupėje (3b pav.). Vartojant 1 karto didesnę dozę, 30 % mankozebo grupės buvo moterys, 36 % piritiostrobino grupėje, 44 % trifloksistrobino grupėje, 38 % miklobutanilo grupėje, 50 % kontrolinės grupės buvo moterys – atitinkamai 38,5 % (3c pav.).
Moteriškų ir patinėlių gręžėjų procentinė dalis po lervinės stadijos fungicido poveikio. (a) Maža dozė (0,1X). (b) Pusė dozės (0,5X). c) Lauko dozė arba visa dozė (1X).
16S sekos analizė parodė, kad bakterijų grupė skyrėsi tarp lervų, šeriamų mankozebu apdorotomis žiedadulkėmis, ir lervų, šeriamų neapdorotomis žiedadulkėmis (4a pav.). Neapdorotų lervų, šeriamų žiedadulkėmis, mikrobų indeksas buvo didesnis nei lervų, šeriamų mankozebu apdorotomis žiedadulkėmis (4b pav.). Nors pastebėtas gausumo skirtumas tarp grupių nebuvo statistiškai reikšmingas, jis buvo žymiai mažesnis nei lervų, šeriamų neapdorotomis žiedadulkėmis (4c pav.). Santykinis gausumas parodė, kad kontrolinių žiedadulkių šeriamų lervų mikrobiota buvo įvairesnė nei lervų, šeriamų mankozebu apdorotomis lervomis (5a pav.). Aprašomoji analizė atskleidė 28 genčių buvimą kontroliniuose ir mankozebu apdorotuose mėginiuose (5b pav.). c Analizė naudojant 18S sekvenavimą reikšmingų skirtumų neparodė (2 papildomas paveikslas).
SAV profiliai, pagrįsti 16S sekomis, buvo palyginti su Shannon gausumu ir stebėtu gausumu tipo lygmeniu. (a) Pagrindinių koordinačių analizė (PCoA), pagrįsta bendra mikrobų bendrijos struktūra neapdorotose žiedadulkėmis maitintose arba kontrolinėse (mėlyna) ir mankozebu maitintose lervose (oranžinė). Kiekvienas duomenų taškas žymi atskirą imtį. PCoA buvo apskaičiuotas naudojant Bray-Curtis atstumą daugiamatėje t skirstinio diagramoje. Ovalai žymi 80 % patikimumo lygį. (b) Dėžutė, neapdoroti Shannon gausumo duomenys (taškai) ir c. Stebimas gausumas. Dėžutėse diagramose pavaizduoti medianos linijos, tarpkvartilinio diapazono (IQR) ir 1,5 × IQR langeliai (n = 3).
Mankozebu apdorotomis ir neapdorotomis žiedadulkėmis mintų lervų mikrobų bendrijų sudėtis. (a) Santykinis mikrobų genčių gausumas lervose. (b) Identifikuotų mikrobų bendrijų šilumos žemėlapis. Delftia (šansų santykis (OR) = 0,67, P = 0,0030) ir Pseudomonas (OR = 0,3, P = 0,0074), Microbacterium (OR = 0,75, P = 0,0617) (OR = 1,5, P = 0,0060); šilumos žemėlapio eilutės grupuojamos naudojant koreliacijos atstumą ir vidutinį jungiamumą.
Mūsų rezultatai rodo, kad kontaktinių (mankozebo) ir sisteminių (pirostrobino ir trifloksistrobino) fungicidų, plačiai naudojamų žydėjimo metu, peroralinis poveikis žymiai sumažino kukurūzų lervų svorio prieaugį ir padidino jų mirtingumą. Be to, mankozebas žymiai sumažino mikrobiomo įvairovę ir gausą priešlėliukės stadijoje. Miklobutanilas, kitas sisteminis fungicidas, reikšmingai sumažino lervų kūno svorio prieaugį esant visoms trims dozėms. Šis poveikis buvo akivaizdus antruoju (5 dieną) ir trečiuoju (8 dieną) tyrimo laiko momentais. Priešingai, ciprodinilas ir kaptanas reikšmingai nesumažino svorio prieaugio ar išgyvenamumo, palyginti su kontroline grupe. Mūsų žiniomis, šis darbas yra pirmasis, kuriame nustatytas skirtingų fungicidų, naudojamų kukurūzų pasėliams apsaugoti tiesioginiu žiedadulkių poveikiu, lauko normų poveikis.
Visi fungicidų apdorojimo būdai reikšmingai sumažino kūno svorio prieaugį, palyginti su kontroliniais gydymais. Mankozebas turėjo didžiausią poveikį lervų kūno svorio prieaugiui – vidutiniškai sumažėjo 51 %, po jo sekė piritiostrobinas. Tačiau kituose tyrimuose nebuvo pranešta apie neigiamą lauko fungicidų dozių poveikį lervų stadijoms44. Nors įrodyta, kad ditiokarbamato biocidai pasižymi mažu ūminiu toksiškumu45, etileno bisditiokarbamatai (EBDCS), tokie kaip mankozebas, gali skilti į karbamido etilensulfidą. Atsižvelgiant į mutageninį poveikį kitiems gyvūnams, šis skaidymosi produktas gali būti atsakingas už pastebėtą poveikį46,47. Ankstesni tyrimai parodė, kad etilentiourėjos susidarymą veikia tokie veiksniai kaip pakilusi temperatūra48, drėgmės lygis49 ir produkto laikymo trukmė50. Tinkamos biocidų laikymo sąlygos gali sušvelninti šį šalutinį poveikį. Be to, Europos maisto saugos tarnyba išreiškė susirūpinimą dėl piritiopido toksiškumo, kuris, kaip įrodyta, yra kancerogeniškas kitų gyvūnų virškinimo sistemai51.
Geriamasis mankozebo, piritiostrobino ir trifloksistrobino vartojimas padidina kukurūzinių gręžinių lervų mirtingumą. Priešingai, miklobutanilis, ciprociklinas ir kaptanas neturėjo įtakos mirtingumui. Šie rezultatai skiriasi nuo Ladurner ir kt.52 rezultatų, kurie parodė, kad kaptanas reikšmingai sumažino suaugusių O. lignaria ir Apis mellifera L. (Hymenoptera, Apisidae) išgyvenamumą. Be to, nustatyta, kad fungicidai, tokie kaip kaptanas ir boskalidas, sukelia lervų mirtingumą52,53,54 arba pakeičia maitinimosi elgseną55. Šie pokyčiai, savo ruožtu, gali turėti įtakos žiedadulkių maistinei kokybei ir galiausiai lervų stadijos energijos prieaugiui. Kontrolinėje grupėje pastebėtas mirtingumas atitiko kitų tyrimų duomenis56,57.
Mūsų darbe pastebėtas patinams palankus lyčių santykis gali būti paaiškintas tokiais veiksniais kaip nepakankamas poravimasis ir prastos oro sąlygos žydėjimo metu, kaip anksčiau O. cornuta atveju teigė Vicens ir Bosch. Nors mūsų tyrime patelės ir patinai turėjo keturias dienas poruotis (laikotarpis, paprastai laikomas pakankamu sėkmingam poravimuisi), mes sąmoningai sumažinome šviesos intensyvumą, kad sumažintume stresą. Tačiau šis pakeitimas gali netyčia trukdyti poravimosi procesui61. Be to, bitės patiria kelias nepalankių oro sąlygų dienas, įskaitant lietų ir žemą temperatūrą (<5 °C), kuri taip pat gali neigiamai paveikti poravimosi sėkmę4,23.
Nors mūsų tyrimas sutelktas į visą lervų mikrobiomą, mūsų rezultatai suteikia įžvalgų apie galimus ryšius tarp bakterijų bendrijų, kurie gali būti labai svarbūs bičių mitybai ir fungicidų poveikiui. Pavyzdžiui, lervų, šeriamų mankozebu apdorotomis žiedadulkėmis, mikrobų bendrijos struktūra ir gausa buvo žymiai mažesnė, palyginti su lervomis, šeriamomis neapdorotomis žiedadulkėmis. Lervose, mintančiose neapdorotomis žiedadulkėmis, dominavo proteobakterijos ir aktinobakterijos, kurios daugiausia buvo aerobinės arba fakultatyviai aerobinės. Yra žinoma, kad Delfto bakterijos, dažniausiai siejamos su pavieniui gyvenančiomis bitėmis, pasižymi antibiotiniu aktyvumu, rodančiu galimą apsauginį vaidmenį nuo patogenų. Kita bakterijų rūšis – Pseudomonas – buvo gausi lervose, šeriamose neapdorotomis žiedadulkėmis, tačiau jų kiekis buvo žymiai mažesnis mankozebu apdorotose lervose. Mūsų rezultatai patvirtina ankstesnius tyrimus, kuriuose Pseudomonas buvo nustatyta kaip viena gausiausių genčių O. bicornis35 ir kitose pavieniui gyvenančiose vapsvose34. Nors eksperimentinių įrodymų apie Pseudomonas vaidmenį O. cornifrons sveikatai nebuvo tirta, nustatyta, kad ši bakterija skatina apsauginių toksinų sintezę vabale Paederus fuscipes ir skatina arginino metabolizmą in vitro 35, 65. Šie stebėjimai rodo galimą vaidmenį virusinėje ir bakterinėje gynyboje O. cornifrons lervų vystymosi metu. Microbacterium yra dar viena mūsų tyrime nustatyta gentis, kuri, kaip pranešama, dideliais kiekiais randama juodosios musės kareivėlio lervose badavimo sąlygomis66. O. cornifrons lervose mikrobakterijos gali prisidėti prie žarnyno mikrobiomo pusiausvyros ir atsparumo streso sąlygomis. Be to, Rhodococcus randama O. cornifrons lervose ir yra žinoma dėl savo detoksikacijos gebėjimų67. Ši gentis taip pat randama A. florea žarnyne, bet labai mažai68. Mūsų rezultatai rodo, kad daugelyje mikrobų taksonų yra daugybė genetinių variantų, kurie gali pakeisti lervų medžiagų apykaitos procesus. Tačiau reikia geriau suprasti O. cornifrons funkcinę įvairovę.
Apibendrinant, rezultatai rodo, kad mankozebas, piritiostrobinas ir trifloksistrobinas sumažino kukurūzinių gręžtuvų lervų kūno svorio prieaugį ir padidino jų mirtingumą. Nors vis labiau nerimaujama dėl fungicidų poveikio apdulkintojams, reikia geriau suprasti šių junginių liekamųjų metabolitų poveikį. Šiuos rezultatus galima įtraukti į rekomendacijas dėl integruotų apdulkintojų valdymo programų, kurios padėtų ūkininkams išvengti tam tikrų fungicidų naudojimo prieš vaismedžių žydėjimą ir jo metu, parenkant fungicidus ir keičiant jų naudojimo laiką arba skatinant naudoti mažiau kenksmingas alternatyvas36. Ši informacija yra svarbi rengiant rekomendacijas dėl pesticidų naudojimo, pavyzdžiui, koreguojant esamas purškimo programas ir keičiant purškimo laiką renkantis fungicidus arba skatinant naudoti mažiau pavojingas alternatyvas. Reikia atlikti tolesnius tyrimus dėl neigiamo fungicidų poveikio lyčių santykiui, maitinimosi elgesiui, žarnyno mikrobiomui ir molekuliniams mechanizmams, lemiantiems kukurūzinių gręžtuvų svorio kritimą ir mirtingumą.
1 ir 2 paveiksluose pateikti 1, 2 ir 3 šaltinių duomenys buvo pateikti „figshare“ duomenų saugykloje DOI: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.24996245 ir https://doi.org/10.6084/m9.figshare.24996233. Šiame tyrime analizuojamos sekos (4, 5 pav.) yra prieinamos NCBI SRA saugykloje, jų registracijos numeris PRJNA1023565.
Bosch, J. ir Kemp, WP Medunešių bičių rūšių, kaip žemės ūkio augalų apdulkintojų, vystymasis ir įsitvirtinimas: Osmia genties (Hymenoptera: Megachilidae) ir vaismedžių pavyzdys. bull. Ntomore. resource. 92, 3–16 (2002).
Parker, MG ir kt. Apdulkinimo praktika ir alternatyvių apdulkintojų suvokimas tarp obuolių augintojų Niujorke ir Pensilvanijoje. Atnaujinta. Žemės ūkis. Maisto sistemos. 35, 1–14 (2020).
Koch I., Lonsdorf EW, Artz DR, Pitts-Singer TL ir Ricketts TH Migdolų apdulkinimo naudojant vietines bites ekologija ir ekonomika. J. Economics. Ntomore. 111, 16–25 (2018).
Lee, E., He, Y. ir Park, Y.-L. Klimato kaitos poveikis tragopanų fenologijai: populiacijos valdymo pasekmės. Climb. Change 150, 305–317 (2018).
Artz, DR ir Pitts-Singer, TL Fungicidinių ir adjuvantinių purškalų poveikis dviejų pavienių bičių (Osmia lignaria ir Megachile rotundata) lizdaviečių sukimui. PloS One 10, e0135688 (2015).
Beauvais, S. ir kt. Mažai toksiškas augalų fungicidas (fenbukonazolas) sutrikdo patinų reprodukcinės kokybės signalus, dėl to sumažėja laukinių pavienių bičių poravimosi sėkmė. J. Apps. ecology. 59, 1596–1607 (2022).
Sgolastra F. ir kt. Neonikotinoidiniai insekticidai ir ergosterolio biosintezė slopina sinergetinį fungicidų mirtingumą trijose bičių rūšyse. Kenkėjų kontrolė. Mokslas. 73, 1236–1243 (2017).
Kuhneman JG, Gillung J, Van Dyck MT, Fordyce RF. ir Danforth BN. Pavienės vapsvų lervos keičia bakterijų įvairovę, kurią žiedadulkės suteikia ant stiebų perinčioms bitėms Osmia cornifrons (Megachilidae). front. microbium. 13, 1057626 (2023).
Dharampal PS, Danforth BN ir Steffan SA. Fermentuotose žiedadulkėse esantys ektosimbiotiniai mikroorganizmai yra tokie pat svarbūs pavienių bičių vystymuisi, kaip ir pačios žiedadulkės. ekologija. evoliucija. 12. e8788 (2022).
Kelderer M., Manici LM., Caputo F. ir Thalheimer M. Tarpueilių sodinimas obelų soduose siekiant kontroliuoti persėjimo ligas: praktinis veiksmingumo tyrimas, pagrįstas mikrobiniais rodikliais. Plant Soil 357, 381–393 (2012).
Martin PL, Kravchik T., Khodadadi F., Achimovich SG ir Peter K. A. Obuolių kartusis puvinys JAV Atlanto vandenyno vidurio dalyje: sukėlėjų rūšių įvertinimas ir regioninių oro sąlygų bei veislių jautrumo įtaka. Phytopathology 111, 966–981 (2021).
Cullen MG, Thompson LJ, Carolan JK, Stout JK ir Stanley DA Fungicidai, herbicidai ir bitės: sisteminė esamų tyrimų ir metodų apžvalga. PLoS One 14, e0225743 (2019).
Pilling, ED ir Jepson, PC. EBI fungicidų ir piretroidinių insekticidų sinerginis poveikis bitėms (Apis mellifera). Pests the Science. 39, 293–297 (1993).
Mussen, EC, Lopez, JE ir Peng, CY Pasirinktų fungicidų poveikis bičių lervų Apis mellifera L. (Hymenoptera: Apidae) augimui ir vystymuisi. Trečiadienis. Ntomore. 33, 1151–1154 (2004).
Van Dyke, M., Mullen, E., Wickstead, D. ir McArt, S. Sprendimų dėl pesticidų naudojimo siekiant apsaugoti apdulkintojus medžių soduose vadovas (Kornelio universitetas, 2018).
Iwasaki, JM ir Hogendoorn, K. Bičių sąlytis su nepesticidais: metodų ir pateiktų rezultatų apžvalga. Žemės ūkis. Ekosistema. Trečiadienis. 314, 107423 (2021).
Kopit AM, Klinger E, Cox-Foster DL, Ramirez RA ir Pitts-Singer TL. Tiekimo tipo ir pesticidų poveikio poveikis Osmia lignaria lervų vystymuisi (Hymenoptera: Megachilidae). Trečiadienis. Ntomore. 51, 240–251 (2022).
Kopit AM ir Pitts-Singer TL Pesticidų poveikio pavienėms bitėms tuščiuose lizduose keliai. Trečiadienis. Ntomore. 47, 499–510 (2018).
Pan, NT ir kt. Naujas biologinio tyrimo protokolas pesticidų toksiškumui suaugusioms japoninėms sodo bitėms (Osmia cornifrons) įvertinti. „The Science“. Ataskaitos 10, 9517 (2020).
Įrašo laikas: 2024 m. gegužės 14 d.