Guizhou provincijoje kritulių sezoninis pasiskirstymas yra netolygus, daugiau kritulių iškrenta pavasarį ir vasarą, tačiau rapsų daigai yra jautrūs sausros stresui rudenį ir žiemą, o tai labai veikia derlių. Garstyčios yra ypatingas aliejinis augalas, daugiausia auginamas Guizhou provincijoje. Jos pasižymi dideliu atsparumu sausrai ir gali būti auginamos kalnuotose vietovėse. Tai gausus sausrai atsparių genų šaltinis. Sausrai atsparių genų atradimas yra labai svarbus norint pagerinti garstyčių veisles ir diegti gemalo išteklius. GRF šeima vaidina labai svarbų vaidmenį augalų augime ir vystymesi bei reaguojant į sausros stresą. Šiuo metu GRF genai rasti Arabidopsis 2, ryžiuose (Oryza sativa) 12, rapsuose 13, medvilnėje (Gossypium hirsutum) 14, kviečiuose (Triticum aestivum) 15, perlinėse sorose (Setaria italica) 16 ir Brassica 17, tačiau pranešimų apie GRF genų aptikimą garstyčiose nėra. Šiame tyrime buvo identifikuoti garstyčių GRF šeimos genai viso genomo lygmeniu ir išanalizuotos jų fizinės bei cheminės savybės, evoliuciniai ryšiai, homologija, konservatyvūs motyvai, genų struktūra, genų dubliavimasis, cis-elementai ir daigų stadija (keturių lapelių stadija). Išsamiai išanalizuoti raiškos modeliai sausros streso metu, siekiant suteikti mokslinį pagrindą tolesniems tyrimams apie galimą BjGRF genų funkciją reaguojant į sausrą ir pateikti kandidatų genus sausrai atsparių garstyčių veisimui.
Brassica juncea genome, naudojant dvi HMMER paieškas, buvo identifikuoti trisdešimt keturi BjGRF genai, kurie visi turi QLQ ir WRC domenus. Identifikuotų BjGRF genų CDS sekos pateiktos papildomoje S1 lentelėje. BjGRF01–BjGRF34 pavadinimai gauti pagal jų vietą chromosomoje. Šios šeimos fizikocheminės savybės rodo, kad aminorūgščių ilgis labai kinta – nuo 261 aminorūgščių (BjGRF19) iki 905 aminorūgščių (BjGRF28). BjGRF izoelektrinis taškas svyruoja nuo 6,19 (BjGRF02) iki 9,35 (BjGRF03), vidutiniškai 8,33, o 88,24 % BjGRF yra bazinis baltymas. Numatomas BjGRF molekulinės masės diapazonas yra nuo 29,82 kDa (BjGRF19) iki 102,90 kDa (BjGRF28); BjGRF baltymų nestabilumo indeksas svyruoja nuo 51,13 (BjGRF08) iki 78,24 (BjGRF19), visi yra didesni nei 40, o tai rodo, kad riebalų rūgščių indeksas svyruoja nuo 43,65 (BjGRF01) iki 78,78 (BjGRF22), vidutinis hidrofiliškumas (GRAVY) svyruoja nuo -1,07 (BjGRF31) iki -0,45 (BjGRF22), visi hidrofiliniai BjGRF baltymai turi neigiamas GRAVY reikšmes, kurios gali būti dėl liekanų sukelto hidrofobiškumo stokos. Subląstelinės lokalizacijos prognozė parodė, kad 31 BjGRF koduojamas baltymas gali būti lokalizuotas branduolyje, BjGRF04 gali būti lokalizuotas peroksisomose, BjGRF25 gali būti lokalizuotas citoplazmoje, o BjGRF28 gali būti lokalizuotas chloroplastuose (1 lentelė). Tai rodo, kad BjGRF gali būti lokalizuoti branduolyje ir atlikti svarbų reguliacinį vaidmenį kaip transkripcijos faktorius.
Filogenetinė GRF šeimų analizė skirtingose rūšyse gali padėti tirti genų funkcijas. Todėl buvo parsisiųstos 35 rapsų, 16 ropių, 12 ryžių, 10 sorų ir 9 Arabidopsis GRF pilno ilgio aminorūgščių sekos ir, remiantis 34 identifikuotais BjGRF genais, sudarytas filogenetinis medis (1 pav.). Trys pošeimiai turi skirtingą narių skaičių; 116 GRF TF yra suskirstyti į tris skirtingas pošeimius (A–C grupės), kuriuose yra atitinkamai 59 (50,86 %), 34 (29,31 %) ir 23 (19,83 %) GRF. Iš jų 34 BjGRF šeimos nariai yra išsibarstę po 3 pošeimius: 13 narių A grupėje (38,24 %), 12 narių B grupėje (35,29 %) ir 9 nariai C grupėje (26,47 %). Garstyčių poliploidizacijos procese BjGRF genų skaičius skirtinguose pošeimiuose yra skirtingas, todėl gali įvykti genų amplifikacija ir praradimas. Verta paminėti, kad C grupėje nėra ryžių ir sorų GRF pasiskirstymo, o B grupėje yra 2 ryžių GRF ir 1 sorų GRF, o dauguma ryžių ir sorų GRF yra sugrupuoti vienoje šakoje, o tai rodo, kad BjGRF yra glaudžiai susiję su dviskilčiais augalais. Iš jų išsamiausi GRF funkcijos Arabidopsis thaliana tyrimai suteikia pagrindą BjGRF funkciniams tyrimams.
Filogenetinis garstyčių medis, įskaitant Brassica napus, Brassica napus, ryžius, soras ir Arabidopsis thaliana GRF šeimos narius.
Pasikartojančių genų analizė garstyčių GRF šeimoje. Pilka linija fone žymi sinchronizuotą bloką garstyčių genome, raudona linija – segmentuotų BjGRF geno pasikartojimų porą;
BjGRF geno raiška sausros streso metu ketvirtojo lapo stadijoje. qRT-PGR duomenys pateikti papildomoje S5 lentelėje. Reikšmingi duomenų skirtumai pažymėti mažosiomis raidėmis.
Kadangi pasaulinis klimatas ir toliau keičiasi, aktualia tyrimų tema tapo augalų gebėjimas susidoroti su sausros stresu ir jų atsparumo mechanizmų gerinimas18. Po sausros pasikeičia augalų morfologinė struktūra, genų raiška ir medžiagų apykaitos procesai, o tai gali lemti fotosintezės nutraukimą ir medžiagų apykaitos sutrikimus, turinčius įtakos augalų derliui ir kokybei19,20,21. Kai augalai pajunta sausros signalus, jie gamina antrinius pasiuntinius, tokius kaip Ca2+ ir fosfatidilinozitolis, padidina tarpląstelinę kalcio jonų koncentraciją ir aktyvuoja baltymų fosforilinimo kelio reguliavimo tinklą22,23. Galutinis tikslinis baltymas tiesiogiai dalyvauja ląstelių gynyboje arba reguliuoja susijusių streso genų raišką per transformacinius faktorius (TF), didindamas augalų atsparumą stresui24,25. Taigi, TF vaidina lemiamą vaidmenį reaguojant į sausros stresą. Pagal į sausros stresą reaguojančių TF seką ir DNR prisijungimo savybes, TF galima suskirstyti į skirtingas šeimas, tokias kaip GRF, ERF, MYB, WRKY ir kitas šeimas26.
GRF genų šeima yra augalui būdingas transkripcijos faktorius (TF), atliekantis svarbų vaidmenį įvairiuose aspektuose, tokiuose kaip augimas, vystymasis, signalo perdavimas ir augalų apsaugos reakcijos27. Nuo tada, kai pirmasis GRF genas buvo identifikuotas *O. sativa*28, daugelyje rūšių buvo identifikuota vis daugiau GRF genų, kurie veikia augalų augimą, vystymąsi ir streso atsaką8, 29, 30, 31, 32. Paskelbus *Brassica juncea* genomo seką, tapo įmanoma identifikuoti BjGRF genų šeimą33. Šiame tyrime visame garstyčių genome buvo identifikuoti 34 BjGRF genai, kurie pagal jų chromosomų padėtį buvo pavadinti BjGRF01–BjGRF34. Visuose juose yra labai konservatyvūs QLQ ir WRC domenai. Fizikinių ir cheminių savybių analizė parodė, kad BjGRF baltymų (išskyrus BjGRF28) aminorūgščių skaičiaus ir molekulinės masės skirtumai nebuvo reikšmingi, o tai rodo, kad BjGRF šeimos nariai gali atlikti panašias funkcijas. Genų struktūros analizė parodė, kad 64,7 % BjGRF genų turėjo 4 egzonus, o tai rodo, kad BjGRF geno struktūra evoliucijos metu yra gana konservatyvi, tačiau BjGRF10, BjGRF16, BjGRP28 ir BjGRF29 genuose egzonų skaičius yra didesnis. Tyrimai parodė, kad egzonų ar intronų pridėjimas arba ištrynimas gali lemti genų struktūros ir funkcijos skirtumus, taip sukuriant naujus genus34,35,36. Todėl spėjame, kad BjGRF intronas evoliucijos metu buvo prarastas, o tai gali sukelti genų funkcijos pokyčius. Remdamiesi esamais tyrimais, taip pat nustatėme, kad intronų skaičius buvo susijęs su genų raiška. Kai gene yra didelis intronų skaičius, genas gali greitai reaguoti į įvairius nepalankius veiksnius.
Genų dubliavimasis yra pagrindinis genominės ir genetinės evoliucijos veiksnys37. Susiję tyrimai parodė, kad genų dubliavimasis ne tik padidina GRF genų skaičių, bet ir padeda generuoti naujus genus, padedančius augalams prisitaikyti prie įvairių nepalankių aplinkos sąlygų38. Šiame tyrime rastos iš viso 48 pasikartojančios genų poros, kurios visos buvo segmentinės dubliavimosi, o tai rodo, kad segmentinės dubliavimosi yra pagrindinis mechanizmas, didinantis genų skaičių šioje šeimoje. Literatūroje pranešama, kad segmentinė dubliavimosi gali veiksmingai skatinti GRF genų šeimos narių amplifikaciją Arabidopsis ir braškėse, ir nė vienoje iš rūšių nebuvo nustatyta šios genų šeimos tandeminės dubliavimosi27,39. Šio tyrimo rezultatai atitinka esamus Arabidopsis thaliana ir braškių šeimų tyrimus, rodančius, kad GRF šeima gali padidinti genų skaičių ir generuoti naujus genus per segmentinę dubliavimosi funkciją skirtinguose augaluose.
Šiame tyrime garstyčiose buvo identifikuoti iš viso 34 BjGRF genai, kurie buvo suskirstyti į 3 pošeimius. Šie genai pasižymėjo panašiais konservatyviais motyvais ir genų struktūromis. Kolinearumo analizė atskleidė 48 segmentų dubliavimosi poras garstyčiose. BjGRF promotoriaus regione yra cis veikiančių elementų, susijusių su šviesos reakcija, hormonų reakcija, aplinkos streso reakcija bei augimu ir vystymusi. 34 BjGRF genų raiška buvo aptikta garstyčių daigų stadijoje (šaknys, stiebai, lapai), o 10 BjGRF genų raiškos modelis sausros sąlygomis. Nustatyta, kad BjGRF genų raiškos modeliai sausros streso metu buvo panašūs ir gali būti panašūs. BjGRF03 ir BjGRF32 genai gali atlikti teigiamą reguliacinį vaidmenį sausros streso metu, o BjGRF06 ir BjGRF23 atlieka vaidmenį sausros streso metu kaip miR396 taikiniai genai. Apskritai mūsų tyrimas suteikia biologinį pagrindą būsimiems BjGRF geno funkcijos atradimams Brassicaceae augaluose.
Šiame eksperimente naudotas garstyčių sėklas pateikė Guizhou aliejinių augalų sėklų tyrimų institutas, Guizhou žemės ūkio mokslų akademija. Pasirinkite visas sėklas ir pasodinkite jas į dirvą (substratas:dirvožemis = 3:1) ir surinkite šaknis, stiebus ir lapus, kai augalai pasieks keturių lapų stadiją. Augalai buvo apdoroti 20 % PEG 6000, kad būtų imituojama sausra, o lapai buvo surinkti po 0, 3, 6, 12 ir 24 valandų. Visi augalų mėginiai buvo nedelsiant užšaldyti skystame azote ir po to laikomi -80 °C temperatūros šaldiklyje kitam bandymui.
Visi šio tyrimo metu gauti arba analizuoti duomenys yra įtraukti į paskelbtą straipsnį ir papildomos informacijos failus.
Įrašo laikas: 2025 m. sausio 22 d.