Šis tyrimas įvertino komercinių produktų mirtingumą, subletalumą ir toksiškumącipermetrinasformulės anuraniniams buožgalviams. Ūminio tyrimo metu 100–800 μg/L koncentracijos buvo tiriamos 96 val. Atliekant lėtinį testą, natūraliai susidarančios cipermetrino koncentracijos (1, 3, 6 ir 20 μg/L) buvo tiriamos dėl mirtingumo, po to 7 dienas buvo atliktas mikrobranduolių tyrimas ir raudonųjų kraujo kūnelių branduolių anomalijos. Komercinės cipermetrino kompozicijos LC50 buožgalviams buvo 273,41 μg L−1. Lėtinio testo metu didžiausia koncentracija (20 μg L-1) lėmė didesnį nei 50% mirtingumą, nes ji nužudė pusę tirtų buožgalvių. Mikrobranduolių testas parodė reikšmingus rezultatus esant 6 ir 20 μg L−1 ir buvo aptikta keletas branduolinių anomalijų, o tai rodo, kad komercinė cipermetrino formulė turi genotoksinį potencialą prieš P. gracilis. Cipermetrinas yra didelė rizika šiai rūšiai, o tai rodo, kad jis gali sukelti daugybę problemų ir paveikti šios ekosistemos dinamiką trumpuoju ir ilguoju laikotarpiu. Todėl galima daryti išvadą, kad komercinės cipermetrino formos turi toksinį poveikį P. gracilis.
Dėl nuolatinės žemės ūkio veiklos plėtros ir intensyvaus taikymokenkėjų kontrolėpriemonių, vandens gyvūnai dažnai susiduria su pesticidais1,2. Vandens išteklių tarša šalia žemės ūkio laukų gali turėti įtakos netikslinių organizmų, pavyzdžiui, varliagyvių, vystymuisi ir išlikimui.
Varliagyviai tampa vis svarbesni vertinant aplinkos matricas. Anuranai laikomi gerais aplinkos teršalų biologiniais rodikliais dėl savo unikalių savybių, tokių kaip sudėtingas gyvavimo ciklas, greitas lervų augimo greitis, trofinė būklė, pralaidi oda10,11, reprodukcijos priklausomybė nuo vandens12 ir neapsaugoti kiaušinėliai11,13,14. Įrodyta, kad mažoji vandens varlė (Physalaemus gracilis), paprastai žinoma kaip verkianti varlė, yra pesticidų taršos bioindikacinė rūšis4,5,6,7,15. Rūšis aptinkama Argentinos, Urugvajaus, Paragvajaus ir Brazilijos stoviuosiuose vandenyse, saugomose teritorijose arba vietovėse su kintamomis buveinėmis1617 ir yra laikoma stabilia pagal IUCN klasifikaciją dėl plataus paplitimo ir skirtingų buveinių toleravimo18.
Buvo pranešta apie subletalinį poveikį varliagyviams po sąlyčio su cipermetrinu, įskaitant buožgalvių elgsenos, morfologinius ir biocheminius pokyčius23, 24, 25, pakitusį mirtingumą ir metamorfozės laiką, fermentinius pokyčius, sumažėjusį perėjimo sėkmę24, 25, hiperaktyvumą26, cholinesterazės aktyvumo slopinimą27 ir 8. Tačiau cipermetrino genotoksinio poveikio varliagyviams tyrimai yra riboti. Todėl svarbu įvertinti anuranų rūšių jautrumą cipermetrinui.
Aplinkos tarša daro įtaką normaliam varliagyvių augimui ir vystymuisi, tačiau rimčiausias neigiamas poveikis yra genetinė DNR žala, kurią sukelia pesticidų poveikis13. Kraujo ląstelių morfologijos analizė yra svarbus biologinis taršos ir galimo medžiagos toksiškumo laukinėms rūšims rodiklis29. Mikrobranduolių testas yra vienas iš dažniausiai naudojamų metodų nustatant cheminių medžiagų genotoksiškumą aplinkoje30. Tai greitas, efektyvus ir nebrangus metodas, kuris yra geras organizmų, tokių kaip varliagyviai, cheminės taršos rodiklis31,32 ir gali suteikti informacijos apie genotoksinių teršalų poveikį33.
Šio tyrimo tikslas buvo įvertinti komercinių cipermetrino preparatų toksinį potencialą mažiems vandens buožgalviams, naudojant mikrobranduolių testą ir ekologinės rizikos vertinimą.
P. gracilis buožgalvių, paveiktų skirtingomis komercinio cipermetrino koncentracijomis ūminiu tyrimo laikotarpiu, suminis mirtingumas (%).
Kaupiamasis P. gracilis buožgalvių mirtingumas (%), veikiamas skirtingos koncentracijos komercinio cipermetrino lėtinio tyrimo metu.
Pastebėtas didelis mirtingumas atsirado dėl genotoksinio poveikio varliagyviams, paveiktiems skirtingos koncentracijos cipermetrino (6 ir 20 μg/L), kaip rodo mikrobranduolių (MN) ir branduolinių anomalijų buvimas eritrocituose. MN susidarymas rodo mitozės klaidas ir yra susijęs su prastu chromosomų prisijungimu prie mikrotubulių, baltymų kompleksų, atsakingų už chromosomų įsisavinimą ir transportavimą, defektais, chromosomų segregacijos klaidomis ir DNR pažeidimo taisymo klaidomis 38, 39 ir gali būti susijęs su pesticidų sukeltu oksidaciniu stresu40, 41. Kiti anomalijos buvo pastebėti esant visoms įvertintoms koncentracijoms. Didėjant cipermetrino koncentracijai, vartojant mažiausią (1 μg/L) ir didžiausią (20 μg/l) dozę, eritrocitų branduoliniai anomalijos padidėjo atitinkamai 5 % ir 20 %. Pavyzdžiui, rūšies DNR pokyčiai gali turėti rimtų pasekmių tiek trumpalaikiam, tiek ilgalaikiam išlikimui, dėl to gali mažėti populiacija, pakisti reprodukcinis tinkamumas, gimininga giminystė, genetinės įvairovės praradimas ir migracijos tempai. Visi šie veiksniai gali turėti įtakos rūšių išlikimui ir išlaikymui42,43. Eritroidinių anomalijų susidarymas gali rodyti citokinezės blokadą, dėl kurios atsiranda nenormalus ląstelių dalijimasis (dvibranduoliai eritrocitai)44,45; daugiasluoksniai branduoliai yra branduolinės membranos išsikišimai su daugybe skilčių46, o kiti eritroidiniai sutrikimai gali būti susiję su DNR amplifikacija, pavyzdžiui, branduoliniai inkstai / pūslelės47. Eritrocitų su branduoliais buvimas gali rodyti deguonies pernešimo sutrikimą, ypač užterštoje vandenyje48,49. Apoptozė rodo ląstelių mirtį50.
Kiti tyrimai taip pat parodė genotoksinį cipermetrino poveikį. Kabaña ir kt.51 parodė, kad Odontophrynus americanus ląstelėse yra mikrobranduolių ir branduolinių pokyčių, tokių kaip dvibranduolinės ląstelės ir apoptotinės ląstelės, 96 valandas veikiant didele cipermetrino koncentracija (5000 ir 10 000 μg L-1). Cipermetrino sukelta apoptozė taip pat buvo aptikta P. biligonigerus52 ir Rhinella arenarum53. Šie rezultatai rodo, kad cipermetrinas turi genotoksinį poveikį daugeliui vandens organizmų ir kad MN ir ENA tyrimas gali būti subletalinio poveikio varliagyviams rodiklis ir gali būti taikomas vietinėms rūšims ir laukinėms populiacijoms, veikiamoms toksinių medžiagų12.
Komercinės cipermetrino formulės kelia didelį pavojų aplinkai (tiek ūmų, tiek lėtinį), o būstinės viršija JAV aplinkos apsaugos agentūros (EPA) lygį54, o tai gali neigiamai paveikti rūšis, jei jos yra aplinkoje. Atliekant lėtinės rizikos vertinimą, mirtingumo NOEC buvo 3 μg L-1, o tai patvirtina, kad vandenyje nustatytos koncentracijos gali kelti pavojų rūšiai55. Mirtinas NOEC R. arenarum lervoms, paveiktoms endosulfano ir cipermetrino mišiniu, po 168 valandų buvo 500 μg L−1; ši reikšmė sumažėjo iki 0,0005 μg L−1 po 336 val. Autoriai rodo, kad kuo ilgesnis poveikis, tuo mažesnės rūšims kenksmingos koncentracijos. Taip pat svarbu pabrėžti, kad NOEC reikšmės buvo didesnės nei P. gracilis tuo pačiu ekspozicijos laiku, o tai rodo, kad rūšies atsakas į cipermetriną yra būdingas rūšiai. Be to, kalbant apie mirtingumą, P. gracilis CHQ reikšmė po cipermetrino poveikio pasiekė 64,67, o tai yra didesnė už JAV aplinkos apsaugos agentūros nustatytą pamatinę vertę54, o R. arenarum lervų CHQ reikšmė taip pat buvo didesnė už šią vertę (CHQ > 388,00 po 336 val.), o tai rodo, kad kai kurioms tirtoms rūšims būdinga didelė ekticidų rizika. Atsižvelgiant į tai, kad P. gracilis metamorfozei užbaigti reikia maždaug 30 dienų56, galima daryti išvadą, kad tirtos cipermetrino koncentracijos gali prisidėti prie populiacijos mažėjimo, neleisdamos užkrėstiems asmenims ankstyvame amžiuje patekti į suaugusiųjų ar dauginimosi stadiją.
Skaičiuojant mikrobranduolių ir kitų eritrocitų branduolio anomalijų rizikos vertinimą, CHQ reikšmės svyravo nuo 14,92 iki 97,00, o tai rodo, kad cipermetrinas turėjo potencialų genotoksinį pavojų P. gracilis net ir jo natūralioje buveinėje. Atsižvelgiant į mirtingumą, didžiausia P. gracilis toleruojamų ksenobiotinių junginių koncentracija buvo 4,24 μg L−1. Tačiau net 1 μg/l koncentracija taip pat parodė genotoksinį poveikį. Dėl šio fakto gali padidėti nenormalių individų skaičius57 ir tai gali turėti įtakos rūšių vystymuisi ir dauginimuisi jų buveinėse, todėl varliagyvių populiacijos mažėja.
Komercinės insekticido cipermetrino formulės parodė didelį ūminį ir lėtinį toksiškumą P. gracilis. Pastebėtas didesnis mirtingumas, greičiausiai dėl toksinio poveikio, kaip rodo mikrobranduolių ir eritrocitų branduolių anomalijos, ypač dantyti branduoliai, skilteliniai branduoliai ir pūslelių branduoliai. Be to, tirtos rūšys padidino ūminį ir lėtinį pavojų aplinkai. Šie duomenys, kartu su ankstesniais mūsų tyrimų grupės tyrimais, parodė, kad net skirtingos komercinės cipermetrino formulės vis dar sumažino acetilcholinesterazės (AChE) ir butirilcholinesterazės (BChE) aktyvumą ir oksidacinį stresą58, o P. gracilis sukėlė plaukimo aktyvumo pokyčius ir burnos apsigimimus59, o tai rodo, kad šios komercinės cipermetrino formos ir subhaliacinės medžiagos turi didelį toksiškumą. Hartmann ir kt. 60 nustatė, kad komercinės cipermetrino formulės buvo toksiškiausios P. gracilis ir kitai tos pačios genties rūšiai (P. cuvieri), palyginti su devyniais kitais pesticidais. Tai rodo, kad teisiškai patvirtintos cipermetrino koncentracijos aplinkos apsaugai gali sukelti didelį mirtingumą ir ilgalaikį gyventojų mažėjimą.
Reikia atlikti tolesnius tyrimus, kad būtų įvertintas pesticido toksiškumas varliagyviams, nes aplinkoje nustatytos koncentracijos gali sukelti didelį mirtingumą ir kelti galimą pavojų P. gracilis. Reikėtų skatinti varliagyvių rūšių tyrimus, nes duomenų apie šiuos organizmus, ypač apie Brazilijos rūšis, yra nedaug.
Lėtinio toksiškumo bandymas truko 168 valandas (7 dienas) statinėmis sąlygomis, o subletalinės koncentracijos buvo: 1, 3, 6 ir 20 μg ai L−1. Abiejuose eksperimentuose 10 buožgalvių vienoje gydymo grupėje buvo įvertinta šešiais pakartojimais, iš viso 60 buožgalvių vienoje koncentracijoje. Tuo tarpu gydymas tik vandeniu buvo neigiama kontrolė. Kiekvieną eksperimentinę sąranką sudarė sterilus stiklinis indas, kurio talpa 500 ml, o tankis 1 buožgalvis 50 ml tirpalo. Kolba buvo uždengta polietileno plėvele, kad neišgaruotų, ir buvo nuolat aeruojama.
Vanduo buvo chemiškai analizuojamas, siekiant nustatyti pesticidų koncentracijas 0, 96 ir 168 val. Pasak Sabin ir kt. 68 ir Martins ir kt. 69, analizės buvo atliktos Santa Marijos federalinio universiteto pesticidų analizės laboratorijoje (LARP), naudojant dujų chromatografiją, sujungtą su trigubo kvadrupolio masės spektrometrija (Varian modelis 1200, Palo Alto, Kalifornija, JAV). Pesticidų kiekybinis nustatymas vandenyje parodytas kaip papildoma medžiaga (SM1 lentelė).
Atliekant mikrobranduolių testą (MNT) ir raudonųjų kraujo kūnelių branduolio anomalijos tyrimą (RNR), buvo ištirta 15 buožgalvių iš kiekvienos gydymo grupės. Buožgalviai buvo anestezuoti 5% lidokainu (50 mg g-170), o kraujo mėginiai buvo paimti širdies punkcija naudojant vienkartinius heparinuotus švirkštus. Ant sterilių mikroskopo stiklelių buvo paruošti kraujo tepinėliai, džiovinami oru, fiksuojami 100% metanoliu (4 °C) 2 min., o po to 15 min tamsoje dažomi 10% Giemsa tirpalu. Proceso pabaigoje stikleliai buvo nuplauti distiliuotu vandeniu, kad būtų pašalintas dėmės perteklius, ir išdžiovinti kambario temperatūroje.
Mažiausiai 1000 raudonųjų kraujo kūnelių iš kiekvieno buožgalvio buvo ištirta naudojant 100 × mikroskopą su 71 objektyvu, siekiant nustatyti MN ir ENA buvimą. Iš viso buvo įvertinta 75 796 raudonųjų kraujo kūnelių iš buožgalvių, atsižvelgiant į cipermetrino koncentraciją ir kontrolę. Genotoksiškumas buvo analizuojamas pagal Carrasco ir kt. metodą. ir Fenech et al.38,72, nustatant šių branduolinių pažeidimų dažnį: (1) branduolinės ląstelės: ląstelės be branduolių; (2) apoptotinės ląstelės: branduolio fragmentacija, užprogramuota ląstelių mirtis; (3) dvibranduolės ląstelės: ląstelės su dviem branduoliais; (4) branduolio pumpurai arba pūslinės ląstelės: ląstelės, turinčios branduolius su mažais branduolio membranos išsikišimais, dydžiu panašaus į mikrobranduolius; (5) kariolizuotos ląstelės: ląstelės, turinčios tik branduolio kontūrą be vidinės medžiagos; (6) dantytos ląstelės: ląstelės su branduoliais, kurių formoje yra akivaizdžių įtrūkimų arba įdubimų, dar vadinamos inksto formos branduoliais; (7) lobulinės ląstelės: ląstelės, kurių branduolio išsikišimai yra didesni už pirmiau minėtas pūsleles; ir (8) mikroląstelės: ląstelės su kondensuotais branduoliais ir sumažinta citoplazma. Pokyčiai buvo lyginami su neigiamos kontrolės rezultatais.
Ūmaus toksiškumo bandymo rezultatai (LC50) buvo analizuojami naudojant GBasic programinę įrangą ir TSK-Trimmed Spearman-Karber metodą74. Lėtinio testo duomenys buvo iš anksto patikrinti dėl klaidų normalumo (Shapiro-Wilks) ir dispersijos homogeniškumo (Bartlett). Rezultatai buvo analizuojami naudojant vienpusę dispersinę analizę (ANOVA). Tukey testas buvo naudojamas duomenims palyginti tarpusavyje, o Dunnett testas buvo naudojamas duomenims tarp gydomosios grupės ir neigiamos kontrolinės grupės palyginti.
LOEC ir NOEC duomenys buvo analizuojami naudojant Dunnett testą. Statistiniai testai atlikti naudojant Statistica 8.0 programinę įrangą (StatSoft), kurios reikšmingumo lygis yra 95% (p < 0,05).
Paskelbimo laikas: 2025-03-13