Fosforilinimas aktyvina pagrindinį augimo reguliatorių DELLA, skatinantį histono H2A prisijungimą prie chromatino Arabidopsis.

DELLA baltymai yra konservuotiaugimo reguliatoriaikurie atlieka pagrindinį vaidmenį augalų vystymesi reaguodami į vidinius ir išorinius signalus. Kaip transkripcijos reguliatoriai, DELLA prisijungia prie transkripcijos faktorių (TF) ir histono H2A per savo GRAS domenus ir yra įdarbinami veikti promotorius. Naujausi tyrimai parodė, kad DELLA stabilumą po transliacijos reguliuoja du mechanizmai: augalų hormono sukelta poliubikvitinacija.giberelinas, o tai lemia greitą jų degradaciją ir konjugaciją su mažu ubikvitino tipo modifikatoriumi (SUMO), kuris padidina jų kaupimąsi. Be to, DELLA aktyvumą dinamiškai reguliuoja du skirtingi glikozilinimo mechanizmai: O-fukozilinimas sustiprina DELLA-TF sąveiką, o O-susieto N-acetilgliukozamino (O-GlcNAc) modifikacija slopina DELLA-TF sąveiką. Tačiau DELLA fosforilinimo vaidmuo neaiškus, nes ankstesni tyrimai parodė prieštaringus rezultatus, kai kurie rodo, kad fosforilinimas skatina arba slopina DELLA degradaciją, o kiti rodo, kad fosforilinimas neturi įtakos jų stabilumui. Čia mes nustatome fosforilinimo vietas GA1-3 represoriuje (RGA), AtDELLA, išgrynintą iš Arabidopsis thaliana masių spektrometrija, ir parodome, kad dviejų RGA peptidų fosforilinimas PolyS ir PolyS / T regionuose padidina RGA aktyvumą skatindamas H2A surišimą ir RGA ryšį su tiksliniais promotoriais. Pažymėtina, kad fosforilinimas neturėjo įtakos RGA-TF sąveikai ar RGA stabilumui. Mūsų tyrimas atskleidžia molekulinį mechanizmą, kuriuo fosforilinimas sukelia DELLA aktyvumą.
Mūsų masės spektrometrinė analizė atskleidė, kad ir Pep1, ir Pep2 buvo labai fosforilinti RGA GA trūkumo Ga1 fone. Be šio tyrimo, fosfoproteominiai tyrimai taip pat atskleidė Pep1 fosforilinimą RGA, nors jo vaidmuo dar nebuvo ištirtas53, 54, 55. Priešingai, Pep2 fosforilinimas anksčiau nebuvo aprašytas, nes šį peptidą buvo galima aptikti tik naudojant RGAGKG transgeną. Nors m1A mutacija, kuri panaikino Pep1 fosforilinimą, tik šiek tiek sumažino RGA aktyvumą augaluose, kartu su m2A ji turėjo papildomą poveikį mažinant RGA aktyvumą (papildomas 6 paveikslas). Svarbu tai, kad Pep1 fosforilinimas buvo žymiai sumažintas GA sustiprintame sly1 mutante, palyginti su ga1, o tai rodo, kad GA skatina RGA defosforilinimą ir sumažina jo aktyvumą. Mechanizmas, kuriuo GA slopina RGA fosforilinimą, reikalauja tolesnio tyrimo. Viena iš galimybių yra tai, kad tai pasiekiama reguliuojant nenustatytą baltymų kinazę. Nors tyrimai parodė, kad ryžiuose GA sumažina CK1 baltymų kinazės EL1 ekspresiją41, mūsų rezultatai rodo, kad aukštesnės eilės Arabidopsis EL1 homologo (AEL1-4) mutacijos nesumažina RGA fosforilinimo. Remiantis mūsų rezultatais, neseniai atliktas fosfoproteominis tyrimas, naudojant Arabidopsis AEL per daug ekspresuojančias linijas ir ael trigubą mutantą, nenustatė jokių DELLA baltymų kaip šių kinazių substratų56. Kai paruošėme rankraštį, buvo pranešta, kad GSK3, genas, koduojantis į GSK3 / SHAGGY panašią kinazę kviečiuose (Triticum aestivum), gali fosforilinti DELLA (Rht-B1b)57, nors Rht-B1b fosforilinimas GSK3 augaluose nebuvo patvirtintas. In vitro fermentinės reakcijos dalyvaujant GSK3, o po to masių spektrometrinė analizė atskleidė tris fosforilinimo vietas, esančias tarp Rht-B1b DELLA ir GRAS domenų (papildomas 3 pav.). Serino ir alanino pakaitalai visose trijose fosforilinimo vietose sumažino Rht-B1b aktyvumą transgeniniuose kviečiuose, o tai atitinka mūsų išvadas, kad alanino pakaitalai Pep2 RGA sumažino RGA aktyvumą. Tačiau in vitro baltymų skilimo tyrimai taip pat parodė, kad fosforilinimas taip pat gali stabilizuoti Rht-B1b57. Tai prieštarauja mūsų rezultatams, rodantiems, kad alanino pakaitalai Pep2 RGA nekeičia jo stabilumo augale. GSK3 kviečiuose yra brassinosteroidams nejautrio baltymo 2 (BIN2) ortologas Arabidopsis 57. BIN2 yra neigiamas BR signalizacijos reguliatorius, o BR suaktyvina savo signalizacijos kelią, sukeldamas BIN2 degradaciją 58. Mes parodėme, kad gydymas BR nesumažina RGA stabilumo 59 arabosphorylsppph (Subaidosphoryls ppf). tai rodo, kad mažai tikėtina, kad RGA bus fosforilintas BIN2.
Visi kiekybiniai duomenys buvo statistiškai išanalizuoti naudojant Excel, o reikšmingi skirtumai nustatyti Stjudento t-testu. Imties dydžiui iš anksto nustatyti statistiniai metodai nebuvo naudojami. Į analizę nebuvo įtraukti jokie duomenys; eksperimentas nebuvo atsitiktinis; ir tyrėjai žinojo apie paskirstymą eksperimento ir rezultatų vertinimo metu. Mėginių dydžiai pateikti paveikslėlių legendose ir neapdorotų duomenų failuose.