DELLA baltymai yra konservuotiaugimo reguliatoriaikurie atlieka pagrindinį vaidmenį augalų vystymesi, reaguojant į vidinius ir išorinius signalus. Kaip transkripcijos reguliatoriai, DELLA jungiasi prie transkripcijos faktorių (TF) ir histono H2A per savo GRAS domenus ir yra pritraukiami veikti promotorius. Naujausi tyrimai parodė, kad DELLA stabilumą po transliacijos reguliuoja du mechanizmai: augalo hormono sukelta poliubikvitinacijagiberelinas, dėl ko jie greitai skaidosi, ir vyksta konjugacija su mažu ubikvitiną primenančiu modifikatoriumi (SUMO), kuris padidina jų kaupimąsi. Be to, DELLA aktyvumą dinamiškai reguliuoja du skirtingi glikozilinimo mechanizmai: O-fukozilinimas sustiprina DELLA-TF sąveiką, o O-sujungtas N-acetilgliukozamino (O-GlcNAc) modifikavimas slopina DELLA-TF sąveiką. Tačiau DELLA fosforilinimo vaidmuo nėra aiškus, nes ankstesni tyrimai parodė prieštaringus rezultatus: vieni teigia, kad fosforilinimas skatina arba slopina DELLA skaidymą, o kiti teigia, kad fosforilinimas neturi įtakos jų stabilumui. Šiame darbe mes nustatome fosforilinimo vietas GA1-3 represoriuje (RGA), AtDELLA, išgrynintame iš Arabidopsis thaliana masių spektrometrijos būdu, ir parodome, kad dviejų RGA peptidų fosforilinimas PolyS ir PolyS/T srityse sustiprina RGA aktyvumą, skatindamas H2A prisijungimą ir RGA asociaciją su taikiniais promotoriais. Pažymėtina, kad fosforilinimas neturėjo įtakos RGA-TF sąveikai ar RGA stabilumui. Mūsų tyrimas atskleidžia molekulinį mechanizmą, kuriuo fosforilinimas sukelia DELLA aktyvumą.
Mūsų masių spektrometrinė analizė parodė, kad tiek Pep1, tiek Pep2 buvo labai fosforilinti RGA GA trūkumo Ga1 fone. Be šio tyrimo, fosfoproteominiai tyrimai taip pat atskleidė Pep1 fosforilinimą RGA, nors jo vaidmuo dar nebuvo ištirtas53,54,55. Priešingai, Pep2 fosforilinimas anksčiau nebuvo aprašytas, nes šį peptidą buvo galima aptikti tik naudojant RGAGKG transgeną. Nors m1A mutacija, kuri panaikino Pep1 fosforilinimą, tik šiek tiek sumažino RGA aktyvumą planta, ji turėjo adityvų poveikį, kai buvo derinama su m2A, mažinant RGA aktyvumą (papildomas 6 paveikslas). Svarbu tai, kad Pep1 fosforilinimas buvo žymiai sumažėjęs GA sustiprintame sly1 mutante, palyginti su ga1, o tai rodo, kad GA skatina RGA defosforilinimą, mažindamas jo aktyvumą. Mechanizmas, kuriuo GA slopina RGA fosforilinimą, reikalauja tolesnio tyrimo. Viena iš galimybių yra ta, kad tai pasiekiama reguliuojant neidentifikuotą baltymų kinazę. Nors tyrimai parodė, kad GA sumažina CK1 baltymų kinazės EL1 ekspresiją ryžiuose41, mūsų rezultatai rodo, kad aukštesnės eilės Arabidopsis EL1 homologo (AEL1-4) mutacijos nesumažina RGA fosforilinimo. Sutinka su mūsų rezultatais, neseniai atliktame fosfoproteomikos tyrime, naudojant Arabidopsis AEL perprodukciją sukeliančias linijas ir ael trigubą mutantą, nebuvo nustatyta jokių DELLA baltymų kaip šių kinazių substratų56. Kai rengėme rankraštį, buvo pranešta, kad GSK3, genas, koduojantis GSK3/SHAGGY tipo kinazę kviečiuose (Triticum aestivum), gali fosforilinti DELLA (Rht-B1b)57, nors Rht-B1b fosforilinimas GSK3 nebuvo patvirtintas in planta. In vitro fermentinės reakcijos, esant GSK3, ir po to atlikta masių spektrometrijos analizė, atskleidė tris fosforilinimo vietas, esančias tarp Rht-B1b DELLA ir GRAS domenų (papildomas 3 pav.). Serino pakeitimas alaninu visose trijose fosforilinimo vietose sumažino Rht-B1b aktyvumą transgeniniuose kviečiuose, o tai atitinka mūsų išvadas, kad alanino pakeitimai Pep2 RGA sumažino RGA aktyvumą. Tačiau in vitro baltymų skaidymo tyrimai papildomai parodė, kad fosforilinimas taip pat gali stabilizuoti Rht-B1b57. Tai prieštarauja mūsų rezultatams, rodantiems, kad alanino pakeitimai Pep2 RGA nekeičia jo stabilumo planta. Kviečiuose esantis GSK3 yra brassinosteroidams nejautraus baltymo 2 (BIN2) ortologas Arabidopsis 57. BIN2 yra neigiamas BR signalizacijos reguliatorius, o BR aktyvuoja jo signalizacijos kelią sukeldamas BIN2 skaidymą 58. Parodėme, kad BR apdorojimas nesumažina RGA stabilumo 59 ar fosforilinimo lygių Arabidopsis (papildomas 2 paveikslas), o tai rodo, kad RGA greičiausiai nebus fosforilinama BIN2.
Visi kiekybiniai duomenys buvo statistiškai analizuojami naudojant „Excel“, o reikšmingi skirtumai nustatyti naudojant Stjudento t testą. Imties dydžiui iš anksto nustatyti nebuvo naudojami jokie statistiniai metodai. Iš analizės nebuvo pašalinta jokių duomenų; eksperimentas nebuvo atsitiktinės atrankos būdu atliktas; tyrėjai žinojo apie paskirstymą eksperimento ir rezultatų vertinimo metu. Imties dydžiai pateikti paveikslėlių aprašuose ir neapdorotų duomenų failuose.
Įrašo laikas: 2025 m. balandžio 15 d.