Šūvio viršūninės meristemos (SAM) augimas yra labai svarbus stiebo architektūrai. Augaliniai hormonaigiberelinai(GA) atlieka pagrindinį vaidmenį koordinuojant augalų augimą, tačiau jų vaidmuo SAM vis dar menkai suprantamas. Čia mes sukūrėme ratiometrinį GA signalizacijos biojutiklį, sukurdami DELLA baltymą, kad slopintume jo esminę reguliavimo funkciją GA transkripcijos atsake, kartu išsaugodami jo degradaciją atpažinus GA. Mes parodome, kad šis skaidymu pagrįstas biojutiklis tiksliai registruoja GA lygio pokyčius ir ląstelių jutimą vystymosi metu. Naudojome šį biojutiklį GA signalizacijos veiklai nustatyti SAM. Mes parodome, kad aukšti GA signalai daugiausia yra ląstelėse, esančiose tarp organų pirmtakų, kurie yra tarpmazginių ląstelių pirmtakai. Naudodami funkcijos padidėjimo ir praradimo metodus, toliau parodome, kad GA reguliuoja ląstelių dalijimosi plokštumos orientaciją, nustatydama kanoninę ląstelių organizaciją tarpmazgiuose, taip skatindama tarpmazgų specifikaciją SAM.
Ūglio viršūninėje meristemoje (SAM), esančioje ūglio viršūnėje, yra niša kamieninių ląstelių, kurių veikla moduliniu ir kartotiniu būdu generuoja šoninius organus ir stiebo mazgus per visą augalo gyvenimą. Kiekvienas iš šių pasikartojančių vienetų arba augalų mazgų apima tarpmazgius ir šoninius organus mazguose bei pažasties meristemas lapų pažastyse1. Vystymosi metu keičiasi augalų mazgų augimas ir organizavimas. Arabidopsis tarpnagių augimas slopinamas vegetacinės stadijos metu, o pažastinės meristemos lieka ramybės rozetės lapų pažastyse. Pereinant į žydėjimo fazę, SAM tampa žiedyno meristema, generuojančia pailgus tarpubamblius ir pažastinius pumpurus, žiedinių lapų pažastyse šakeles, o vėliau ir belapius žiedus2. Nors padarėme didelę pažangą suprasdami mechanizmus, kurie kontroliuoja lapų, gėlių ir šakų atsiradimą, palyginti mažai žinoma apie tarpmazgių atsiradimą.
GA erdvinio ir laiko pasiskirstymo supratimas padės geriau suprasti šių hormonų funkcijas skirtinguose audiniuose ir skirtinguose vystymosi etapuose. RGA-GFP sintezės skilimo, išreikšto veikiant jo paties promotoriui, vizualizacija suteikia svarbios informacijos apie bendro GA lygio reguliavimą šaknyse 15, 16. Tačiau RGA ekspresija audiniuose skiriasi17 ir yra reguliuojama GA18. Taigi, diferencinė RGA promotoriaus ekspresija gali sukelti fluorescencijos modelį, stebimą naudojant RGA-GFP, todėl šis metodas nėra kiekybinis. Visai neseniai bioaktyvus fluoresceinas (Fl) pažymėtas GA19, 20 atskleidė GA kaupimąsi šaknies endokortekse ir jo ląstelių lygio reguliavimą GA transportu. Neseniai GA FRET jutiklis nlsGPS1 parodė, kad GA lygiai koreliuoja su ląstelių pailgėjimu šaknyse, gijose ir tamsiai užaugintuose hipokotiluose21. Tačiau, kaip matėme, GA koncentracija nėra vienintelis parametras, kontroliuojantis GA signalizacijos veiklą, nes ji priklauso nuo sudėtingų jutimo procesų. Remdamiesi savo supratimu apie DELLA ir GA signalizacijos kelius, pranešame apie degradacija pagrįsto ratiometrinio biojutiklio, skirto GA signalizacijai, kūrimą ir apibūdinimą. Norėdami sukurti šį kiekybinį biojutiklį, naudojome mutantinį GA jautrų RGA, kuris buvo sulietas su fluorescenciniu baltymu ir visur ekspresuojamas audiniuose, taip pat GA nejautrų fluorescencinį baltymą. Mes parodome, kad mutantiniai RGA baltymų susiliejimai netrukdo endogeniniam GA signalizavimui, kai yra visur išreikšti, ir kad šis biosensorius gali kiekybiškai įvertinti signalizacijos aktyvumą, atsirandantį dėl GA įvesties ir GA signalo apdorojimo jutimo aparatu su didele erdvine ir laiko skiriamąja geba. Naudojome šį biojutiklį, norėdami nustatyti GA signalizacijos aktyvumo erdvėlaikį pasiskirstymą ir kiekybiškai įvertinti, kaip GA reguliuoja ląstelių elgesį SAM epidermyje. Mes parodome, kad GA reguliuoja SAM ląstelių, esančių tarp organų pirmtakų, padalijimo plokštumos orientaciją, taip apibrėžiant kanoninę tarpmazgio ląstelių organizaciją.
Galiausiai paklausėme, ar qmRGA gali pranešti apie endogeninio GA lygio pokyčius naudojant augančius hipokotilus. Anksčiau parodėme, kad nitratas skatina augimą didindamas GA sintezę ir, savo ruožtu, DELLA34 skaidymą. Atitinkamai, mes pastebėjome, kad hipokotilo ilgis pUBQ10:: qmRGA sodinukuose, auginamuose esant gausiam nitratų tiekimui (10 mM NO3−), buvo žymiai ilgesnis nei daigų, auginamų nitratų trūkumo sąlygomis (papildomas 6a pav.). Atsižvelgiant į augimo reakciją, GA signalai buvo didesni sėjinukų, auginamų 10 mM NO3- sąlygomis, hipokotiluose nei sodinukuose, auginamuose be nitratų (papildomas 6b pav., c). Taigi, qmRGA taip pat leidžia stebėti GA signalizacijos pokyčius, kuriuos sukelia endogeniniai GA koncentracijos pokyčiai.
Norėdami suprasti, ar qmRGA aptiktas GA signalizacijos aktyvumas priklauso nuo GA koncentracijos ir GA suvokimo, kaip ir tikėtasi remiantis jutiklio konstrukcija, išanalizavome trijų GID1 receptorių ekspresiją vegetatyviniuose ir reprodukciniuose audiniuose. Sėjinukuose GID1-GUS reporterio linija parodė, kad GID1a ir c buvo labai išreikšti skilčialapiuose (3a–c pav.). Be to, visi trys receptoriai buvo išreikšti lapuose, šoninėse šaknies primordijose, šaknų galiukuose (išskyrus GID1b šaknies dangtelį) ir kraujagyslių sistemoje (3a–c pav.). Žiedyno SAM GUS signalus aptikome tik GID1b ir 1c (papildomas 7a–c pav.). Hibridizacija in situ patvirtino šiuos raiškos modelius ir dar labiau parodė, kad GID1c buvo vienodai išreikštas žemu lygiu SAM, o GID1b parodė didesnę ekspresiją SAM periferijoje (papildomas 7d – l pav.). PGID1b::2xmTQ2-GID1b transliacijos sintezė taip pat atskleidė laipsnišką GID1b ekspresijos diapazoną: nuo mažos arba jos nebuvimo SAM centre iki didelės ekspresijos prie organų sienų (papildomas 7m pav.). Taigi GID1 receptoriai nėra tolygiai pasiskirstę audiniuose ir viduje. Vėlesniuose eksperimentuose taip pat pastebėjome, kad pernelyg didelė GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) ekspresija padidino hipokotilų qmRGA jautrumą išoriniam GA naudojimui (3d pav., e). Priešingai, fluorescencija, išmatuota qd17mRGA hipokotiluose, nebuvo jautri gydymui GA3 (3f pav., g). Atliekant abu tyrimus, daigai buvo apdoroti didelėmis GA koncentracijomis (100 μM GA3), kad būtų įvertintas greitas jutiklio elgesys, kai gebėjimas prisijungti prie GID1 receptoriaus buvo sustiprintas arba prarastas. Kartu šie rezultatai patvirtina, kad qmRGA biosensorius atlieka kombinuotą funkciją kaip GA ir GA jutiklis, ir rodo, kad diferencinė GID1 receptoriaus išraiška gali žymiai pakeisti jutiklio spinduliuotę.
Iki šiol GA signalų pasiskirstymas SAM lieka neaiškus. Todėl naudojome qmRGA ekspresuojančius augalus ir pCLV3::mCherry-NLS kamieninių ląstelių reporterį35, norėdami apskaičiuoti didelės skiriamosios gebos kiekybinius GA signalizacijos veiklos žemėlapius, sutelkdami dėmesį į L1 sluoksnį (epidermį; 4a, b pav., žr. Metodai ir papildomi metodai), nes L3 vaidina pagrindinį vaidmenį kontroliuojant SAM augimą. Čia pCLV3 :: mCherry-NLS išraiška suteikė fiksuotą geometrinį atskaitos tašką analizuojant GA signalizacijos aktyvumo erdvinį ir laiką37. Nors manoma, kad GA yra būtinas šoninių organų vystymuisi4, pastebėjome, kad GA signalai buvo maži gėlių pirmtakuose (P), pradedant nuo P3 stadijos (4a, b pav.), o jaunų P1 ir P2 primordiumų aktyvumas buvo vidutinis, panašus į centrinėje srityje (4a, b pav.). Didesnis GA signalizacijos aktyvumas buvo aptiktas ties organo prado ribomis, pradedant nuo P1/P2 (ribos šonuose) ir pasiekiant aukščiausią tašką ties P4, taip pat visose periferinės srities ląstelėse, esančiose tarp pradmenų (4a, b pav. ir papildomas 8a, b pav.). Šis didesnis GA signalizacijos aktyvumas buvo pastebėtas ne tik epidermyje, bet ir L2 bei viršutiniuose L3 sluoksniuose (papildomas 8b pav.). GA signalų, aptiktų SAM naudojant qmRGA, modelis laikui bėgant taip pat nepakito (papildomi 8c–f, k pav.). Nors qd17mRGA konstrukcija buvo sistemingai sumažinta T3 augalų SAM iš penkių nepriklausomų linijų, kurias išsamiai apibūdinome, galėjome išanalizuoti fluorescencijos modelius, gautus naudojant pRPS5a :: VENUS-2A-TagBFP konstrukciją (papildomas 8g – j, l pav.). Šioje kontrolinėje linijoje SAM buvo aptikti tik nedideli fluorescencijos santykio pokyčiai, tačiau SAM centre pastebėjome aiškų ir netikėtą VENUS sumažėjimą, susijusį su TagBFP. Tai patvirtina, kad qmRGA pastebėtas signalizacijos modelis atspindi nuo GA priklausomą mRGA-VENUS degradaciją, bet taip pat parodo, kad qmRGA gali pervertinti GA signalizacijos aktyvumą meristemų centre. Apibendrinant galima pasakyti, kad mūsų rezultatai atskleidžia GA signalizacijos modelį, kuris pirmiausia atspindi pradmenų pasiskirstymą. Tokį tarppirminio regiono (IPR) pasiskirstymą lemia laipsniškas didelis GA signalizacijos aktyvumas tarp besivystančio prado ir centrinio regiono, o tuo pačiu metu GA signalizacijos aktyvumas pirmtakuose mažėja (4c, d pav.).
GID1b ir GID1c receptorių pasiskirstymas (žr. aukščiau) rodo, kad skirtinga GA receptorių ekspresija padeda formuoti GA signalizacijos aktyvumo modelį SAM. Pasidomėjome, ar gali būti susijęs su skirtingu GA kaupimu. Norėdami ištirti šią galimybę, naudojome nlsGPS1 GA FRET jutiklį21. Padidėjęs aktyvinimo dažnis buvo aptiktas nlsGPS1 SAM, apdorotame 10 μM GA4+7 100 min (papildomas 9a – e pav.), o tai rodo, kad nlsGPS1 reaguoja į GA koncentracijos pokyčius SAM, kaip ir šaknyse21. Erdvinis nlsGPS1 aktyvavimo dažnio pasiskirstymas atskleidė santykinai žemus GA lygius išoriniuose SAM sluoksniuose, tačiau parodė, kad jie buvo aukštesni SAM centre ir prie sienų (4e pav. ir papildomas 9a, c pav.). Tai rodo, kad GA taip pat yra platinamas SAM, kurio erdvinis modelis yra panašus į tą, kurį atskleidė qmRGA. Kaip papildomą metodą, mes taip pat apdorojome SAM tik fluorescencine GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) arba Fl kaip neigiamą kontrolę. Fl signalas buvo paskirstytas visoje SAM, įskaitant centrinę sritį ir pirmtaką, nors ir mažesniu intensyvumu (4j pav. ir papildomas 10d pav.). Priešingai, visi trys GA-Fl kaupėsi konkrečiai pirmykštės ribose ir skirtingu laipsniu likusioje IPR dalyje, o GA7-Fl kaupiasi didžiausiame IPR domene (4k pav. ir papildomas 10a, b pav.). Kiekybiškai įvertinus fluorescencijos intensyvumą, paaiškėjo, kad IPR ir ne IPR intensyvumo santykis buvo didesnis GA-Fl apdorotų SAM, palyginti su Fl apdorotų SAM (4l pav. ir papildomas 10c pav.). Kartu šie rezultatai rodo, kad GA yra didesnėmis koncentracijomis IPR ląstelėse, esančiose arčiausiai organo sienos. Tai rodo, kad SAM GA signalizacijos aktyvumo modelis atsiranda tiek dėl skirtingos GA receptorių ekspresijos, tiek dėl skirtingo GA kaupimosi IPR ląstelėse šalia organų sienų. Taigi, mūsų analizė atskleidė netikėtą erdvėlaikinį GA signalizacijos modelį su mažesniu aktyvumu SAM centre ir pradinėje dalyje bei didesnį IPR aktyvumą periferiniame regione.
Norėdami suprasti diferencinio GA signalizacijos aktyvumo vaidmenį SAM, išanalizavome ryšį tarp GA signalizacijos aktyvumo, ląstelių išsiplėtimo ir ląstelių dalijimosi, naudodamiesi SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS realiuoju laiku uždelstą vaizdą. Atsižvelgiant į GA vaidmenį augimo reguliavime, buvo tikimasi teigiamos koreliacijos su ląstelių plėtimosi parametrais. Todėl pirmiausia palyginome GA signalizacijos aktyvumo žemėlapius su ląstelės paviršiaus augimo greičio žemėlapiais (kaip tam tikros ląstelės ir dukterinių ląstelių plėtimosi stiprumo pavyzdžiu dalijantis) ir augimo anizotropijos žemėlapiais, kurie matuoja ląstelių plėtimosi kryptį (taip pat čia naudojami tam tikrai ląstelei ir dukterinėms ląstelėms dalijimosi metu; 5a,b pav. ir papildymai). Mūsų SAM ląstelių paviršiaus augimo greičio žemėlapiai atitinka ankstesnius stebėjimus38, 39, o pasienio augimo tempai yra minimalūs, o besivystančiose gėlės – didžiausi (5a pav.). Pagrindinių komponentų analizė (PCA) parodė, kad GA signalizacijos aktyvumas neigiamai koreliavo su ląstelės paviršiaus augimo intensyvumu (5c pav.). Mes taip pat parodėme, kad pagrindinės variacijos ašys, įskaitant GA signalizacijos įvestį ir augimo intensyvumą, buvo statmenos krypčiai, kurią lemia didelė CLV3 ekspresija, o tai patvirtina, kad likusiose analizėse ląstelės neįtrauktos į SAM centrą. Spearmano koreliacijos analizė patvirtino PCA rezultatus (5d pav.), Nurodant, kad didesni GA signalai IPR nesukėlė didesnio ląstelių išsiplėtimo. Tačiau koreliacinė analizė atskleidė nedidelę teigiamą koreliaciją tarp GA signalizacijos aktyvumo ir augimo anizotropijos (5c, d pav.), o tai rodo, kad didesnis GA signalizavimas IPR įtakoja ląstelių augimo kryptį ir galbūt ląstelių dalijimosi plokštumos padėtį.
a, b SAM vidutinio paviršiaus augimo (a) ir augimo anizotropijos (b) šilumos žemėlapiai, apskaičiuoti per septynis nepriklausomus augalus (naudojami atitinkamai kaip ląstelių plėtimosi stiprumo ir krypties pavyzdžiai). c PCA analizė apėmė šiuos kintamuosius: GA signalą, paviršiaus augimo intensyvumą, paviršiaus augimo anizotropiją ir CLV3 ekspresiją. PCA 1 komponentas daugiausia neigiamai koreliavo su paviršiaus augimo intensyvumu ir teigiamai koreliavo su GA signalu. PCA 2 komponentas daugiausia teigiamai koreliavo su paviršiaus augimo anizotropija ir neigiamai koreliavo su CLV3 ekspresija. Procentai rodo kiekvieno komponento paaiškintus pokyčius. d Spearmano koreliacijos analizė tarp GA signalo, paviršiaus augimo intensyvumo ir paviršiaus augimo anizotropijos audinių skalėje, išskyrus CZ. Skaičius dešinėje yra Spearman rho reikšmė tarp dviejų kintamųjų. Žvaigždutės nurodo atvejus, kai koreliacija / neigiama koreliacija yra labai reikšminga. e 3D Col-0 SAM L1 ląstelių vizualizacija konfokaline mikroskopija. Naujos ląstelių sienelės, susidariusios SAM (bet ne pradmenyje) po 10 val., yra nuspalvintos pagal jų kampo reikšmes. Spalvų juosta rodoma apatiniame dešiniajame kampe. Įdėklas rodo atitinkamą 3D vaizdą 0 val. Eksperimentas buvo pakartotas du kartus su panašiais rezultatais. f Dėžutės diagramos rodo ląstelių dalijimosi greitį IPR ir ne IPR Col-0 SAM (n = 10 nepriklausomų augalų). Centrinė linija rodo medianą, o dėžutės ribos nurodo 25 ir 75 procentilius. Ūsai nurodo minimalias ir didžiausias vertes, nustatytas naudojant R programinę įrangą. P vertės buvo gautos naudojant Welcho dviejų uodegų t testą. g, h Scheminė diagrama, rodanti (g), kaip išmatuoti naujos ląstelės sienelės (rausvai raudonos spalvos) kampą radialinės krypties atžvilgiu nuo SAM centro (balta punktyrinė linija) (atsižvelgiama tik į ūmaus kampo vertes, ty 0–90°), ir (h) apskritimo / šoninės ir radialinės kryptys meristemoje. i Ląstelių dalijimosi plokštumos orientacijos dažnio histogramos per SAM (tamsiai mėlyna), IPR (vidutinė mėlyna) ir ne IPR (šviesiai mėlyna). P vertės buvo gautos dvipusiu Kolmogorovo-Smirnovo testu. Eksperimentas buvo pakartotas du kartus su panašiais rezultatais. j IPR ląstelių dalijimosi plokštumos orientacijos dažnio histogramos atitinkamai aplink P3 (šviesiai žalia), P4 (vidutinė žalia) ir P5 (tamsiai žalia). P vertės buvo gautos dvipusiu Kolmogorovo-Smirnovo testu. Eksperimentas buvo pakartotas du kartus su panašiais rezultatais.
Todėl toliau ištyrėme ryšį tarp GA signalizacijos ir ląstelių dalijimosi aktyvumo, nustatydami naujai susidariusias ląstelių sieneles tyrimo metu (5e pav.). Šis metodas leido išmatuoti ląstelių dalijimosi dažnį ir kryptį. Keista, bet mes nustatėme, kad ląstelių dalijimosi dažnis IPR ir likusioje SAM dalyje (ne IPR, 5f pav.) buvo panašus, o tai rodo, kad GA signalizacijos skirtumai tarp IPR ir ne IPR ląstelių reikšmingos įtakos ląstelių dalijimuisi. Tai ir teigiama koreliacija tarp GA signalizacijos ir augimo anizotropijos paskatino mus apsvarstyti, ar GA signalizacijos veikla gali turėti įtakos ląstelių dalijimosi plokštumos orientacijai. Išmatavome naujosios ląstelės sienelės orientaciją kaip smailųjį kampą, palyginti su radialine ašimi, jungiančia meristemos centrą ir naujosios ląstelės sienelės centrą (5e-i pav.) ir pastebėjome aiškią tendenciją, kad ląstelės dalijasi kampais, artimais 90° radialinei ašiai, o didžiausi dažniai stebimi ties 70-80° ir 230 2-6 % (2302-6%). (5e,i pav.), atitinkančius ląstelių dalijimąsi periferine/skersine kryptimi (5h pav.). Norėdami ištirti GA signalizacijos indėlį į šį ląstelių dalijimosi elgesį, išanalizavome ląstelių dalijimosi parametrus IPR ir ne IPR atskirai (5i pav.). Pastebėjome, kad dalijimosi kampo pasiskirstymas IPR ląstelėse skyrėsi nuo ne IPR ląstelėse arba visose SAM ląstelėse, o IPR ląstelės turi didesnę šoninio / apskrito ląstelių dalijimosi dalį, ty 70–80 ° ir 80–90 ° (atitinkamai 33,86% ir 30,71%, atitinkamos proporcijos) (2 pav.). Taigi, mūsų stebėjimai atskleidė ryšį tarp didelio GA signalizacijos ir ląstelių dalijimosi plokštumos orientacijos, artimos periferinei krypčiai, panašiai kaip koreliacija tarp GA signalizacijos aktyvumo ir augimo anizotropijos (5c, d pav.). Norėdami toliau nustatyti šios asociacijos erdvinį išsaugojimą, išmatavome padalijimo plokštumos orientaciją IPR ląstelėse, supančiose pradmenį, pradedant nuo P3, nes didžiausias GA signalizacijos aktyvumas buvo aptiktas šiame regione, pradedant nuo P4 (4 pav.). IPR dalijimosi kampai aplink P3 ir P4 neparodė statistiškai reikšmingų skirtumų, nors IPR aplink P4 buvo pastebėtas padidėjęs šoninių ląstelių dalijimosi dažnis (5j pav.). Tačiau IPR ląstelėse aplink P5 ląstelių dalijimosi plokštumos orientacijos skirtumas tapo statistiškai reikšmingas, smarkiai išaugo skersinių ląstelių dalijimosi dažnis (5j pav.). Kartu šie rezultatai rodo, kad GA signalizacija gali kontroliuoti ląstelių dalijimosi orientaciją SAM, o tai atitinka ankstesnes ataskaitas 40, 41, kad didelis GA signalizavimas gali sukelti IPR ląstelių dalijimosi šoninę orientaciją.
Prognozuojama, kad IPR ląstelės nebus įtrauktos į pradmenis, o į tarpmazgius 2, 42, 43. Dėl IPR ląstelių dalijimosi skersinės orientacijos gali atsirasti tipiškas lygiagrečių išilginių epidermio ląstelių eilių organizavimas tarpmazgiuose. Mūsų aukščiau aprašyti stebėjimai rodo, kad GA signalizacija greičiausiai vaidina svarbų vaidmenį šiame procese reguliuojant ląstelių dalijimosi kryptį.
Dėl kelių DELLA genų funkcijos praradimo atsiranda konstitucinis GA atsakas, o della mutantai gali būti naudojami šiai hipotezei patikrinti44. Pirmiausia išanalizavome penkių DELLA genų ekspresijos modelius SAM. GUS linijos transkripcijos suliejimas45 atskleidė, kad GAI, RGA, RGL1 ir RGL2 (daug mažesniu mastu) buvo išreikšti SAM (papildomi 11a–d pav.). Hibridizacija in situ taip pat parodė, kad GAI mRNR kaupiasi specifiškai pirmtakuose ir besivystančiose gėlėse (papildomas 11e pav.). RGL1 ir RGL3 mRNR buvo aptikta visame SAM vainiklyje ir senesnėse gėlėse, o RGL2 mRNR buvo gausiau pasienio regione (papildomas 11f – h pav.). Konfokalinis pRGL3::RGL3-GFP SAM vaizdavimas patvirtino ekspresiją, pastebėtą atliekant in situ hibridizaciją, ir parodė, kad RGL3 baltymas kaupiasi centrinėje SAM dalyje (papildomas 11i pav.). Naudodami pRGA::GFP-RGA liniją taip pat nustatėme, kad RGA baltymas kaupiasi SAM, tačiau jo gausa mažėja ties riba, pradedant nuo P4 (papildomas 11j pav.). Pažymėtina, kad RGL3 ir RGA ekspresijos modeliai atitinka didesnį GA signalizacijos aktyvumą IPR, kaip nustatyta qmRGA (4 pav.). Be to, šie duomenys rodo, kad visi DELLA yra išreikšti SAM ir kad jų išraiška bendrai apima visą SAM.
Toliau išanalizavome ląstelių dalijimosi parametrus laukinio tipo SAM (Ler, kontrolė) ir gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della penketuke (pasauliniame) mutantuose (6a, b pav.). Įdomu tai, kad pastebėjome statistiškai reikšmingą ląstelių dalijimosi kampo dažnių pasiskirstymą della global mutantinėje SAM, palyginti su laukiniu tipu (6c pav.). Tokį della global mutanto pokytį lėmė 80–90° kampų dažnio padidėjimas (34,71 %, palyginti su 24,55 %) ir, mažesniu mastu, 70–80° kampų (23,78 % prieš 20,18%), ty atitinkančių skersinius ląstelių dalijimusi (6c pav.). Neskersinių padalijimų dažnis (0–60°) taip pat buvo mažesnis della global mutant (6c pav.). Skersinio ląstelių dalijimosi dažnis reikšmingai padidėjo della global mutanto SAM (6b pav.). Skersinių ląstelių dalijimosi dažnis IPR taip pat buvo didesnis della global mutantuose, palyginti su laukiniu tipu (6d pav.). Už IPR srities laukinio tipo ląstelių dalijimosi kampai pasiskirstė tolygiau, o della global mutantas pirmenybę teikė tangentiniam dalijimuisi, pavyzdžiui, IPR (6e pav.). Taip pat kiekybiškai įvertinome ląstelių dalijimosi orientaciją ga2 oksidazės (ga2ox) penktadalių mutantų (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 ir ga2ox6-2), GA neaktyvaus mutanto fone, kuriame kaupiasi GA, SAM. Atsižvelgiant į GA lygių padidėjimą, penkerių ga2ox mutantų žiedyno SAM buvo didesnis nei Col-0 (papildomas 12a, b pav.), o, palyginti su Col-0, penktadalis ga2ox SAM parodė aiškiai skirtingą ląstelių dalijimosi kampų pasiskirstymą, o kampo dažnis padidėjo nuo 50°, ty vėl pasidalijo 900°. (papildomas 12a–c pav.). Taigi parodome, kad konstitucinis GA signalizacijos aktyvinimas ir GA kaupimasis sukelia šoninių ląstelių dalijimąsi IPR ir likusioje SAM dalyje.
a, b PI dažyto Ler (a) ir pasaulinio della mutanto (b) SAM L1 sluoksnio 3D vizualizacija naudojant konfokalinę mikroskopiją. Naujos ląstelių sienelės, susidariusios SAM (bet ne pradinėje) per 10 valandų, rodomos ir nuspalvintos pagal jų kampo reikšmes. Įdėklas rodo SAM 0 val. Spalvų juosta rodoma apatiniame dešiniajame kampe. Rodyklė (b) rodo suderintų ląstelių failų pavyzdį visuotiniame della mutante. Eksperimentas buvo pakartotas du kartus su panašiais rezultatais. Ląstelių dalijimosi plokštumos orientacijų dažnio pasiskirstymo palyginimas visame SAM (d), IPR (e) ir ne IPR (f) tarp Ler ir globalios della. P vertės buvo gautos naudojant dvipusį Kolmogorovo-Smirnov testą. f, g Col-0 (i) ir pCUC2::gai-1-VENUS (j) transgeninių augalų PI dažytų SAM konfokalinių vaizdų 3D vizualizacija. Plokštelėse (a, b) pavaizduotos naujos ląstelių sienelės (bet ne pradmenys), susidariusios SAM per 10 val. Eksperimentas buvo pakartotas du kartus su panašiais rezultatais. h–j Ląstelių dalijimosi plokštumos orientacijų, esančių visame SAM (h), IPR (i) ir ne IPR (j) tarp Col-0 ir pCUC2::gai-1-VENUS augalų, dažnio pasiskirstymo palyginimas. P vertės buvo gautos naudojant dvipusį Kolmogorovo – Smirnov testą.
Toliau išbandėme GA signalizacijos slopinimo poveikį konkrečiai IPR. Šiuo tikslu mes panaudojome skilčialapių puodelio 2 (CUC2) promotorių, kad paskatintume dominuojančio neigiamo gai-1 baltymo, sujungto su VENUS, ekspresiją (pCUC2::gai-1-VENUS linijoje). Laukinio tipo SAM CUC2 promotorius skatina daugumos IPR ekspresiją SAM, įskaitant pasienio ląsteles, nuo P4, ir panaši specifinė ekspresija buvo pastebėta pCUC2::gai-1-VENUS augaluose (žr. toliau). Ląstelių dalijimosi kampų pasiskirstymas per pCUC2::gai-1-VENUS augalų SAM arba IPR reikšmingai nesiskyrė nuo laukinio tipo, nors netikėtai nustatėme, kad ląstelės be IPR šiuose augaluose dalijasi didesniu 80–90° dažniu (6f – j pav.).
Buvo pasiūlyta, kad ląstelių dalijimosi kryptis priklauso nuo SAM geometrijos, ypač nuo tempimo įtempio, kurį sukelia audinių kreivumas46. Todėl paklausėme, ar SAM forma buvo pakeista della global mutantuose ir pCUC2 :: gai-1-VENUS augaluose. Kaip buvo pranešta anksčiau12, della globaliojo mutanto SAM dydis buvo didesnis nei laukinio tipo (papildomi 13a, b, d pav.). CLV3 ir STM RNR hibridizacija in situ patvirtino meristemos išsiplėtimą della mutantuose ir toliau parodė kamieninių ląstelių nišos šoninį išsiplėtimą (papildomas 13e, f, h, i pav.). Tačiau abiejų genotipų SAM kreivumas buvo panašus (papildomas 13k pav., m, n, p). Stebėjome panašų gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della keturgubo mutanto dydžio padidėjimą be kreivumo pokyčių, palyginti su laukiniu tipu (papildomas 13c pav., d, g, j, l, o, p). Ląstelių dalijimosi orientacijos dažnis taip pat buvo paveiktas della keturgubo mutanto, bet mažesniu mastu nei della monolitinio mutanto (papildomas 12d – f pav.). Šis dozavimo efektas, kartu su kreivumo nebuvimu, rodo, kad likutinis RGL3 aktyvumas Della keturgubo mutante riboja ląstelių dalijimosi orientacijos pokyčius, atsiradusius dėl DELLA aktyvumo praradimo, ir kad šoninio ląstelių dalijimosi pokyčiai atsiranda reaguojant į GA signalizacijos aktyvumo pokyčius, o ne į SAM geometrijos pokyčius. Kaip aprašyta aukščiau, CUC2 promotorius skatina IPR ekspresiją SAM, pradedant nuo P4 (papildomas 14a, b pav.), o priešingai, pCUC2::gai-1-VENUS SAM buvo mažesnio dydžio, bet didesnio kreivumo (papildomas 14c – h pav.). Šis pCUC2::gai-1-VENUS SAM morfologijos pokytis gali lemti skirtingą mechaninių įtempių pasiskirstymą, palyginti su laukiniu tipu, kai dideli apskritimo įtempiai prasideda mažesniu atstumu nuo SAM centro47. Arba pCUC2::gai-1-VENUS SAM morfologijos pokyčiai gali atsirasti dėl regioninių mechaninių savybių pokyčių, kuriuos sukelia transgeno ekspresija48. Abiem atvejais tai gali iš dalies kompensuoti GA signalizacijos pokyčių poveikį, padidindama tikimybę, kad ląstelės pasiskirstys apskritime / skersine kryptimi, paaiškindami mūsų stebėjimus.
Apibendrinant, mūsų duomenys patvirtina, kad didesnis GA signalas vaidina aktyvų vaidmenį IPR ląstelių dalijimosi plokštumos šoninėje orientacijoje. Jie taip pat rodo, kad meristemos kreivumas taip pat turi įtakos ląstelių dalijimosi plokštumos orientacijai IPR.
Skersinė padalijimo plokštumos orientacija IPR dėl didelio GA signalizacijos aktyvumo rodo, kad GA iš anksto sutvarko radialinį ląstelių failą epidermyje SAM viduje, kad apibrėžtų ląstelių organizaciją, kuri vėliau bus rasta epidermio tarpmazgėje. Iš tiesų, tokie ląstelių failai dažnai buvo matomi della global mutantų SAM vaizduose (6b pav.). Taigi, norėdami toliau ištirti GA signalizacijos SAM erdvinio modelio vystymosi funkciją, naudojome laiko intervalo vaizdavimą, kad analizuotume erdvinį ląstelių organizavimą IPR laukinio tipo (Ler ir Col-0), della global mutantuose ir pCUC2::gai-1-VENUS transgeniniuose augaluose.
Mes nustatėme, kad qmRGA parodė, kad GA signalizacijos aktyvumas IPR padidėjo nuo P1/P2 ir pasiekė aukščiausią tašką ties P4, o šis modelis laikui bėgant išliko pastovus (4a-f pav. ir papildomas 8c-f, k pav.). Norėdami išanalizuoti erdvinį ląstelių organizavimą IPR su didėjančiu GA signalu, mes pažymėjome Ler IPR ląsteles virš P4 ir šonuose pagal jų vystymosi likimą, analizuotą praėjus 34 valandoms po pirmojo stebėjimo, ty daugiau nei du plastidų laikus, leidžiančius mums sekti IPR ląsteles pradinio vystymosi metu nuo P1 / P2 iki P4. Naudojome tris skirtingas spalvas: geltoną toms ląstelėms, kurios buvo integruotos į pradmenį šalia P4, žalią toms, kurios buvo IPR, ir violetinę toms, kurios dalyvavo abiejuose procesuose (7a–c pav.). t0 (0 val.) priešais P4 buvo matomi 1–2 IPR ląstelių sluoksniai (7a pav.). Kaip ir tikėtasi, kai šios ląstelės dalijasi, jos tai darė daugiausia per skersinio padalijimo plokštumą (7a–c pav.). Panašūs rezultatai buvo gauti naudojant Col-0 SAM (orientuojantis į P3, kurio kraštinės raukšlės panašiai kaip P4 Ler), nors šiame genotipe gėlių ribose susidariusi raukšlė greičiau paslėpė IPR ląsteles (7g–i pav.). Taigi, IPR ląstelių dalijimosi modelis iš anksto suskirsto ląsteles į radialines eilutes, kaip ir tarpmazguose. Radialinių eilučių organizavimas ir IPR ląstelių lokalizacija tarp nuoseklių organų rodo, kad šios ląstelės yra tarpmazginės pirmtakės.
Čia mes sukūrėme ratiometrinį GA signalizacijos biojutiklį, qmRGA, kuris leidžia kiekybiškai atvaizduoti GA signalizacijos aktyvumą, susijusį su kombinuotomis GA ir GA receptorių koncentracijomis, tuo pačiu sumažinant trukdžius endogeniniams signalizacijos keliams, taip suteikiant informaciją apie GA funkciją ląstelių lygiu. Šiuo tikslu sukūrėme modifikuotą DELLA baltymą mRGA, kuris prarado gebėjimą surišti DELLA sąveikos partnerius, tačiau išlieka jautrus GA sukeltai proteolizei. qmRGA reaguoja tiek į egzogeninius, tiek į endogeninius GA lygio pokyčius, o jo dinaminės jutimo savybės leidžia įvertinti GA signalizacijos aktyvumo erdvėlaikius pokyčius vystymosi metu. qmRGA taip pat yra labai lanksti priemonė, nes ją galima pritaikyti skirtingiems audiniams pakeičiant jo ekspresijai naudojamą promotorių (jei reikia), o atsižvelgiant į konservuotą GA signalizacijos kelio pobūdį ir PFYRE motyvą tarp gaubtasėklių, tikėtina, kad jį bus galima perkelti į kitas rūšis22. Atsižvelgiant į tai, taip pat buvo įrodyta, kad lygiavertė ryžių SLR1 DELLA baltymo (HYY497AAA) mutacija slopina SLR1 augimo slopinimo aktyvumą ir tik šiek tiek sumažina jo GA sukeltą skilimą, panašiai kaip mRGA23. Pažymėtina, kad naujausi Arabidopsis tyrimai parodė, kad viena aminorūgšties mutacija PFYRE domene (S474L) pakeitė RGA transkripcijos aktyvumą, nedarant įtakos jo gebėjimui sąveikauti su transkripcijos faktoriaus partneriais50. Nors ši mutacija yra labai artima 3 aminorūgščių pakaitalams, esantiems mRGA, mūsų tyrimai rodo, kad šios dvi mutacijos keičia skirtingas DELLA savybes. Nors dauguma transkripcijos faktoriaus partnerių jungiasi prie DELLA26, 51 LHR1 ir SAW domenų, kai kurios konservuotos aminorūgštys PFYRE domene gali padėti stabilizuoti šias sąveikas.
Tarpmazgių vystymasis yra pagrindinis augalų architektūros ir derliaus gerinimo bruožas. qmRGA atskleidė didesnį GA signalizacijos aktyvumą IPR tarpmazginėse progenitorinėse ląstelėse. Derindami kiekybinį vaizdavimą ir genetiką, parodėme, kad GA signalizacijos modeliai SAM epidermyje uždeda žiedines / skersines ląstelių dalijimosi plokštumas, formuodami ląstelių dalijimosi organizaciją, reikalingą tarpmazgių vystymuisi. Kūrimo metu buvo nustatyti keli ląstelių dalijimosi plokštumos orientacijos reguliatoriai52,53. Mūsų darbas yra aiškus pavyzdys, kaip GA signalizacijos veikla reguliuoja šį ląstelių parametrą. DELLA gali sąveikauti su iš anksto sulankstytais baltymų kompleksais41, todėl GA signalizacija gali reguliuoti ląstelių dalijimosi plokštumos orientaciją, tiesiogiai paveikdama žievės mikrotubulų orientaciją 40, 41, 54, 55. Netikėtai parodėme, kad SAM didesnio GA signalizacijos aktyvumo koreliacija buvo ne ląstelių pailgėjimas ar dalijimasis, o tik augimo anizotropija, o tai atitinka tiesioginį GA poveikį ląstelių dalijimosi krypčiai IPR. Tačiau negalime atmesti galimybės, kad šis poveikis taip pat gali būti netiesioginis, pavyzdžiui, tarpininkaujant GA sukeltam ląstelių sienelių minkštėjimui56. Ląstelių sienelių savybių pokyčiai sukelia mechaninį įtempimą 57, 58, kuris taip pat gali turėti įtakos ląstelių dalijimosi plokštumos orientacijai, paveikdamas žievės mikrotubulių orientaciją 39, 46, 59. Bendras GA sukelto mechaninio įtempio ir tiesioginio GA mikrotubulų orientacijos reguliavimo poveikis gali būti susijęs su specifinio ląstelių dalijimosi orientacijos modelio IPR generavimu, siekiant apibrėžti tarpmazgius, todėl norint išbandyti šią idėją, reikia atlikti tolesnius tyrimus. Panašiai ankstesniuose tyrimuose buvo pabrėžta su DELLA sąveikaujančių baltymų TCP14 ir 15 svarba kontroliuojant tarpmazgių susidarymą60, 61 ir šie veiksniai gali tarpininkauti GA veikimui kartu su BREVIPEDICELLUS (BP) ir PENNYWISE (PNY), kurie reguliuoja tarpmazgių vystymąsi ir, kaip įrodyta, turi įtakos GA signalizacijai2, 62. Atsižvelgiant į tai, kad DELLA sąveikauja su brassinosteroidų, etileno, jazmono rūgšties ir abscizo rūgšties (ABA) signalizacijos keliais63, 64 ir kad šie hormonai gali turėti įtakos mikrotubulų orientacijai65, GA poveikį ląstelių dalijimosi orientacijai taip pat gali lemti kiti hormonai.
Ankstyvieji citologiniai tyrimai parodė, kad vidinis ir išorinis Arabidopsis SAM regionai yra reikalingi tarpmazgių vystymuisi 2, 42. Tai, kad GA aktyviai reguliuoja ląstelių dalijimąsi vidiniuose audiniuose12, palaiko dvigubą GA funkciją reguliuojant meristemą ir tarpmazgių dydį SAM. Kryptinio ląstelių dalijimosi modelis taip pat yra griežtai reguliuojamas vidiniame SAM audinyje, ir šis reguliavimas yra būtinas stiebo augimui52. Bus įdomu ištirti, ar GA taip pat vaidina vaidmenį orientuojant ląstelių dalijimosi plokštumą vidinėje SAM organizacijoje, taip sinchronizuodamas SAM tarpmazgų specifikaciją ir plėtrą.
Augalai buvo auginami in vitro dirvožemyje arba 1x Murashige-Skoog (MS) terpėje (Duchefa), papildytoje 1% sacharozės ir 1% agaro (Sigma) standartinėmis sąlygomis (16 h šviesa, 22 °C), išskyrus hipokotilų ir šaknų augimo eksperimentus, kuriuose daigai buvo auginami vertikaliose plokštelėse esant pastoviai šviesai ir 22 °C. Nitratų eksperimentams augalai buvo auginami modifikuotoje MS terpėje (bioWORLD augalų terpė), papildytos pakankamu nitratu (0 arba 10 mM KNO3), 0,5 mM NH4-sukcinatu, 1% sacharozės ir 1% A-agaro (Sigma) ilgos dienos sąlygomis.
GID1a cDNR, įterpta į pDONR221, buvo rekombinuota su pDONR P4-P1R-pUBQ10 ir pDONR P2R-P3-mCherry į pB7m34GW, kad būtų sukurtas pUBQ10::GID1a-mCherry. IDD2 DNR, įterpta į pDONR221, buvo rekombinuota į pB7RWG266, kad būtų sukurtas p35S: IDD2-RFP. Norint sukurti pGID1b::2xmTQ2-GID1b, 3,9 kb fragmentas prieš GID1b koduojančią sritį ir 4,7 kb fragmentas, turintis GID1b cDNR (1,3 kb) ir terminatorius (3,4 kb), pirmiausia buvo amplifikuotas naudojant pradmenis, esančius 3 papildomoje lentelėje, o po to PDONR įterpiamas į pDONRfirmo4 ir Fish-P1R. pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific) ir galiausiai rekombinuotas su pDONR221 2xmTQ268 į pGreen 012567 tikslinį vektorių, naudojant Gateway klonavimą. Norint sukurti pCUC2::LSSmOrange, CUC2 promotoriaus seka (3229 bp prieš ATG), po kurios seka kodavimo seka didelio Stokso poslinkio mOrange (LSSmOrange)69 su N7 branduolio lokalizacijos signalu ir NOS transkripcijos terminatoriumi, buvo surinkta į pGreen kanamicino nukreipimo sistemos vektorių, naudojant gabinfacijos nukreipimo vektorių3. (Invitrogen). Dvejetainis augalo vektorius buvo įvestas į Agrobacterium tumefaciens padermę GV3101 ir atitinkamai į Nicotiana benthamiana lapus Agrobacterium infiltracijos metodu ir į Arabidopsis thaliana Col-0 gėlių panardinimo metodu. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry ir pCLV3::mCherry-NLS qmRGA buvo išskirtos atitinkamai iš atitinkamų kryžių F3 ir F1 palikuonių.
RNR in situ hibridizacija buvo atlikta maždaug 1 cm ilgio ūglių galiukuose72, kurie buvo surinkti ir nedelsiant užfiksuoti FAA tirpale (3, 7% formaldehidas, 5% acto rūgštis, 50% etanolis), iš anksto atšaldytame iki 4 ° C. Po 2 × 15 minučių vakuuminio apdorojimo fiksatorius buvo pakeistas ir mėginiai inkubuojami per naktį. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 ir RGL3 cDNR ir jų 3'-UTR antisensiniai zondai buvo susintetinti naudojant pradmenis, parodytus 3 papildomoje lentelėje, kaip aprašyta Rosier ir kt.73. Digoksigeninu pažymėti zondai buvo imunodektiški naudojant digoksigenino antikūnus (3000 kartų praskiedimas; Roche, katalogo numeris: 11 093 274 910), o pjūviai buvo nudažyti 5-brom-4-chlor-3-indolilfosfatu (BCIP)0 / digoksigenino 2 kartus. (NBT, 200 kartų praskiedimas) tirpalu.
Įrašo laikas: 2025 m. vasario 10 d.