Ūglio viršūninės meristemos (SAM) augimas yra labai svarbus stiebo architektūrai. Augalų hormonaigiberelinai(GA) atlieka pagrindinius vaidmenis koordinuojant augalų augimą, tačiau jų vaidmuo SAM vis dar menkai suprantamas. Šiame darbe sukūrėme ratiometrinį GA signalizacijos biosensorių, modifikuodami DELLA baltymą taip, kad jis slopintų jo esminę reguliavimo funkciją GA transkripcijos atsake, tuo pačiu išsaugant jo degradaciją, kai jis atpažįsta GA. Parodome, kad šis degradacija pagrįstas biosensorius tiksliai fiksuoja GA lygių pokyčius ir ląstelių jutimą vystymosi metu. Šį biosensorių panaudojome GA signalizacijos aktyvumui SAM kartografuoti. Parodome, kad stiprūs GA signalai daugiausia yra ląstelėse, esančiose tarp organų pradmenų, kurie yra tarpbamblių ląstelių pirmtakai. Naudodami funkcijos įgijimo ir praradimo metodus, toliau parodome, kad GA reguliuoja ląstelių dalijimosi plokštumos orientaciją, nustatydamas kanoninę tarpbamblių ląstelių organizaciją ir taip skatindamas tarpbamblių specifikaciją SAM.
Ūglio viršūnėje esanti ūglio viršūnėje yra kamieninių ląstelių niša, kurių aktyvumas moduliniu ir iteraciniu būdu per visą augalo gyvenimą generuoja šoninius organus ir stiebo mazgus. Kiekvienas iš šių pasikartojančių vienetų, arba augalo mazgų, apima tarpbamblius ir šoninius organus mazguose bei pažastų meristemas lapų pažastyse1. Augalo mazgų augimas ir organizacija vystymosi metu kinta. Arabidopsis atveju vegetacinės stadijos metu tarpbamblių augimas yra slopinamas, o pažastų meristemos lieka ramybės būsenoje rozetės lapų pažastyse. Pereinant į žydėjimo fazę, SAM tampa žiedyno meristema, suformuodama pailgus tarpbamblius ir pažastų pumpurus, šakeles žiedinių lapų pažastyse, o vėliau – belapius žiedus2. Nors padarėme didelę pažangą suprasdami mechanizmus, kurie kontroliuoja lapų, žiedų ir šakų atsiradimą, gana mažai žinoma apie tai, kaip atsiranda tarpbambliai.
GA erdvinio ir laikino pasiskirstymo supratimas padės geriau suprasti šių hormonų funkcijas skirtinguose audiniuose ir skirtinguose vystymosi etapuose. RGA-GFP susiliejimo, ekspresuojamo veikiant jo paties promotoriui, degradacijos vizualizavimas suteikia svarbios informacijos apie bendro GA kiekio reguliavimą šaknyse15,16. Tačiau RGA raiška skirtinguose audiniuose skiriasi17 ir yra reguliuojama GA18. Taigi, skirtinga RGA promotoriaus raiška gali lemti fluorescencijos modelį, stebimą su RGA-GFP, todėl šis metodas nėra kiekybinis. Visai neseniai bioaktyviu fluoresceinu (Fl) žymėtas GA19,20 atskleidė GA kaupimąsi šaknų endokortekse ir jo ląstelinio lygio reguliavimą GA pernaša. Neseniai GA FRET jutiklis nlsGPS1 parodė, kad GA kiekis koreliuoja su ląstelių pailgėjimu šaknyse, filamentuose ir tamsiai augančiuose hipokotiluose21. Tačiau, kaip matėme, GA koncentracija nėra vienintelis parametras, kontroliuojantis GA signalizacijos aktyvumą, nes ji priklauso nuo sudėtingų jutimo procesų. Remdamiesi savo DELLA ir GA signalizacijos kelių supratimu, pateikiame degradacijos pagrindu sukurto ratiometrinio biosensoriaus, skirto GA signalizacijai, sukūrimą ir charakterizavimą. Šiam kiekybiniam biosensoriui sukurti panaudojome mutantinį GA jautrų RGA, kuris buvo sulietas su fluorescenciniu baltymu ir visur ekspresuojamas audiniuose, taip pat GA nejautrų fluorescencinį baltymą. Parodome, kad mutantinio RGA baltymo susiliejimai netrukdo endogeniniam GA signalizacijai, kai jie visur ekspresuojami, ir kad šis biosensorius gali kiekybiškai įvertinti signalizacijos aktyvumą, atsirandantį tiek dėl GA įvesties, tiek dėl GA signalo apdorojimo jutimo aparatu, naudojant didelę erdvėlaikio skiriamąją gebą. Šį biosensorių panaudojome GA signalizacijos aktyvumo erdvėlaikio pasiskirstymui nustatyti ir kiekybiškai įvertinti, kaip GA reguliuoja ląstelių elgesį SAM epidermyje. Parodome, kad GA reguliuoja SAM ląstelių, esančių tarp organų pradmenų, dalijimosi plokštumos orientaciją, taip apibrėždamas kanoninę internodo ląstelių organizaciją.
Galiausiai, paklausėme, ar qmRGA gali pranešti apie endogeninių GA lygių pokyčius, naudojant augančius hipokotilus. Anksčiau parodėme, kad nitratas stimuliuoja augimą, didindamas GA sintezę ir, savo ruožtu, DELLA34 skaidymą. Atitinkamai, pastebėjome, kad pUBQ10::qmRGA daigų, auginamų esant gausiam nitratų kiekiui (10 mM NO3−), hipokotilo ilgis buvo žymiai ilgesnis nei daigų, auginamų esant nitratų trūkumui (papildomas 6a pav.). Atitinka augimo atsaką, GA signalai buvo didesni daigų, auginamų esant 10 mM NO3−, hipokotiluose nei daigų, auginamų be nitratų (papildomas 6b, c pav.). Taigi, qmRGA taip pat leidžia stebėti GA signalizacijos pokyčius, kuriuos sukelia endogeniniai GA koncentracijos pokyčiai.
Norėdami suprasti, ar qmRGA aptiktas GA signalizacijos aktyvumas priklauso nuo GA koncentracijos ir GA suvokimo, kaip ir tikėtasi remiantis jutiklio konstrukcija, išanalizavome trijų GID1 receptorių raišką vegetatyviniuose ir reprodukciniuose audiniuose. Daiguose GID1-GUS reporterių linija parodė, kad GID1a ir c buvo labai ekspresuojami sėklaskilčiuose (3a–c pav.). Be to, visi trys receptoriai buvo ekspresuojami lapuose, šoninėse šaknų atžalynėse, šaknų viršūnėse (išskyrus GID1b šaknies kepurėlę) ir kraujagyslių sistemoje (3a–c pav.). Žiedynų SAM aptikome GUS signalus tik GID1b ir 1c (papildomas 7a–c pav.). In situ hibridizacija patvirtino šiuos raiškos modelius ir papildomai parodė, kad GID1c buvo tolygiai ekspresuojamas žemu lygiu SAM, o GID1b parodė didesnę raišką SAM periferijoje (papildomas 7d–l pav.). pGID1b::2xmTQ2-GID1b transliacinė sintezė taip pat atskleidė laipsnišką GID1b ekspresijos diapazoną – nuo mažos arba jokios ekspresijos SAM centre iki didelės ekspresijos organų kraštuose (papildomas 7m pav.). Taigi, GID1 receptoriai nėra tolygiai pasiskirstę audiniuose ir jų viduje. Vėlesniuose eksperimentuose taip pat pastebėjome, kad GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) per didelė raiška padidino qmRGA jautrumą hipokotiluose išoriniam GA taikymui (3d pav., e). Priešingai, qd17mRGA išmatuota fluorescencija hipokotilyje nebuvo jautri GA3 apdorojimui (3f pav., g). Abiejų tyrimų metu daigai buvo apdoroti didelėmis GA koncentracijomis (100 μM GA3), siekiant įvertinti greitą jutiklio elgseną, kai sustiprėjo arba išnyko gebėjimas prisijungti prie GID1 receptoriaus. Šie rezultatai kartu patvirtina, kad qmRGA biosensorius atlieka kombinuotą GA ir GA jutiklio funkciją, ir rodo, kad skirtinga GID1 receptoriaus raiška gali reikšmingai moduliuoti jutiklio spinduliavimo gebą.
Iki šiol GA signalų pasiskirstymas SAM lieka neaiškus. Todėl, norėdami apskaičiuoti didelės skiriamosios gebos kiekybinius GA signalizacijos aktyvumo žemėlapius, daugiausia dėmesio skirdami L1 sluoksniui (epidermiui; 4a, b pav., žr. Metodai ir papildomi metodai), panaudojome qmRGA ekspresuojančius augalus ir pCLV3::mCherry-NLS kamieninių ląstelių reporterį35, nes L1 vaidina pagrindinį vaidmenį kontroliuojant SAM augimą36. Čia pCLV3::mCherry-NLS raiška suteikė fiksuotą geometrinį atskaitos tašką GA signalizacijos aktyvumo erdvinio ir laikino pasiskirstymo analizei37. Nors GA laikomas būtinu šoninių organų vystymuisi4, pastebėjome, kad GA signalai žiedų pradmenyje (P) buvo silpni, pradedant nuo P3 stadijos (4a, b pav.), o jauni P1 ir P2 pradmenys pasižymėjo vidutiniu aktyvumu, panašiu į centrinę sritį (4a, b pav.). Didesnis GA signalizacijos aktyvumas buvo aptiktas organų pradmenų ribose, pradedant nuo P1/P2 (ribas dengiančiose pusėse) ir pasiekiant piką ties P4, taip pat visose periferinės srities ląstelėse, esančiose tarp pradmenų (4a, b pav. ir papildomas 8a, b pav.). Šis didesnis GA signalizacijos aktyvumas buvo pastebėtas ne tik epidermyje, bet ir L2 bei viršutiniuose L3 sluoksniuose (papildomas 8b pav.). SAM, naudojant qmRGA, aptiktų GA signalų modelis laikui bėgant taip pat nepakito (papildomas 8c–f, k pav.). Nors qd17mRGA konstrukcija buvo sistemingai sumažinta T3 augalų SAM iš penkių nepriklausomų linijų, kurias išsamiai apibūdinome, galėjome išanalizuoti fluorescencijos modelius, gautus naudojant pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP konstrukciją (papildomas 8g–j, l pav.). Šioje kontrolinėje linijoje SAM aptikti tik nedideli fluorescencijos santykio pokyčiai, tačiau SAM centre pastebėjome aiškų ir netikėtą VENUS sumažėjimą, susijusį su TagBFP. Tai patvirtina, kad qmRGA stebimas signalizacijos modelis atspindi nuo GA priklausomą mRGA-VENUS degradaciją, bet taip pat rodo, kad qmRGA gali pervertinti GA signalizacijos aktyvumą meristemos centre. Apibendrinant, mūsų rezultatai atskleidžia GA signalizacijos modelį, kuris pirmiausia atspindi pradmenų pasiskirstymą. Šis tarppraimerių regiono (IPR) pasiskirstymas atsiranda dėl laipsniško didelio GA signalizacijos aktyvumo įsitvirtinimo tarp besivystančio pradmens ir centrinio regiono, tuo pačiu metu GA signalizacijos aktyvumas pradmenyje mažėja (4c, d pav.).
GID1b ir GID1c receptorių pasiskirstymas (žr. aukščiau) rodo, kad skirtinga GA receptorių raiška padeda formuoti GA signalizacijos aktyvumo modelį SAM. Svarstėme, ar gali būti susijęs skirtingas GA kaupimasis. Norėdami ištirti šią galimybę, panaudojome nlsGPS1 GA FRET jutiklį21. Padidėjęs aktyvacijos dažnis buvo aptiktas nlsGPS1 SAM, apdorotame 10 μM GA4+7 100 min. (papildomas 9a–e pav.), o tai rodo, kad nlsGPS1 reaguoja į GA koncentracijos pokyčius SAM, kaip ir šaknyse21. Erdvinis nlsGPS1 aktyvacijos dažnio pasiskirstymas atskleidė santykinai mažus GA lygius išoriniuose SAM sluoksniuose, tačiau parodė, kad jie buvo padidėję SAM centre ir pakraščiuose (4e pav. ir papildomas 9a, c pav.). Tai rodo, kad GA taip pat pasiskirsto SAM su erdviniu modeliu, panašiu į tą, kurį atskleidžia qmRGA. Kaip papildomą metodą, SAM taip pat apdorojome fluorescenciniu GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) arba vien Fl kaip neigiamą kontrolę. Fl signalas pasiskirstė visame SAM, įskaitant centrinį regioną ir pradmenį, nors ir mažesniu intensyvumu (4j pav. ir papildomas 10d pav.). Priešingai, visi trys GA-Fl kaupėsi specifiškai pradmens ribose ir skirtingu laipsniu likusioje IP R dalyje, o GA7-Fl kaupėsi didžiausioje IP R srityje (4k pav. ir papildomas 10a, b pav.). Fluorescencijos intensyvumo kiekybinis įvertinimas parodė, kad IP R ir ne IP R intensyvumo santykis buvo didesnis GA-Fl apdorotoje SAM, palyginti su Fl apdorota SAM (4l pav. ir papildomas 10c pav.). Kartu šie rezultatai rodo, kad GA yra didesnėmis koncentracijomis IP R ląstelėse, kurios yra arčiausiai organo ribos. Tai rodo, kad SAM GA signalizacijos aktyvumo modelis atsiranda tiek dėl skirtingos GA receptorių ekspresijos, tiek dėl skirtingo GA kaupimosi IP R ląstelėse šalia organo ribų. Taigi, mūsų analizė atskleidė netikėtą GA signalizacijos erdvėlaikį, kai mažesnis aktyvumas buvo SAM centre ir pradmenyje, o didesnis aktyvumas – IPR periferiniame regione.
Norėdami suprasti diferencinio GA signalizacijos aktyvumo vaidmenį SAM, analizavome GA signalizacijos aktyvumo, ląstelių plėtimosi ir ląstelių dalijimosi koreliaciją, naudodami SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS realaus laiko pagreitinto vaizdo gavimą. Atsižvelgiant į GA vaidmenį augimo reguliavime, buvo tikėtina teigiama koreliacija su ląstelių plėtimosi parametrais. Todėl pirmiausia palyginome GA signalizacijos aktyvumo žemėlapius su ląstelių paviršiaus augimo greičio žemėlapiais (kaip ląstelių plėtimosi stiprumo rodikliu tam tikroje ląstelėje ir dukterinėse ląstelėse dalijimosi metu) ir su augimo anizotropijos žemėlapiais, kurie matuoja ląstelių plėtimosi kryptingumą (taip pat naudojami čia tam tikrai ląstelei ir dukterinėms ląstelėms dalijimosi metu; 5a, b pav., žr. Metodai ir papildomi metodai). Mūsų SAM ląstelių paviršiaus augimo greičio žemėlapiai atitinka ankstesnius stebėjimus38,39, kai minimalus augimo greitis yra pasienyje, o maksimalus – besivystančiose gėlėse (5a pav.). Pagrindinių komponenčių analizė (PCA) parodė, kad GA signalizacijos aktyvumas neigiamai koreliavo su ląstelių paviršiaus augimo intensyvumu (5c pav.). Taip pat parodėme, kad pagrindinės variacijos ašys, įskaitant GA signalizacijos įvestį ir augimo intensyvumą, buvo statmenos krypčiai, kurią lemia didelė CLV3 raiška, patvirtindamos ląstelių pašalinimą iš SAM centro likusiose analizėse. Spearmano koreliacijos analizė patvirtino PCA rezultatus (5d pav.), rodančią, kad didesni GA signalai IPR nesukėlė didesnio ląstelių plėtimosi. Tačiau koreliacijos analizė atskleidė nedidelę teigiamą koreliaciją tarp GA signalizacijos aktyvumo ir augimo anizotropijos (5c, d pav.), o tai rodo, kad didesnis GA signalizacijos lygis IPR turi įtakos ląstelių augimo krypčiai ir galbūt ląstelių dalijimosi plokštumos padėčiai.
a, b SAM vidutinio paviršiaus augimo (a) ir augimo anizotropijos (b) šilumos žemėlapiai, apskaičiuoti pagal septynis nepriklausomus augalus (atitinkamai naudojami kaip ląstelių plėtimosi stiprumo ir krypties rodikliai). c PCA analizė apėmė šiuos kintamuosius: GA signalą, paviršiaus augimo intensyvumą, paviršiaus augimo anizotropiją ir CLV3 raišką. PCA 1 komponentas daugiausia neigiamai koreliavo su paviršiaus augimo intensyvumu ir teigiamai koreliavo su GA signalu. PCA 2 komponentas daugiausia teigiamai koreliavo su paviršiaus augimo anizotropija ir neigiamai koreliavo su CLV3 raiška. Procentai rodo kiekvieno komponento paaiškinamą variaciją. d Spearmano koreliacijos analizė tarp GA signalo, paviršiaus augimo intensyvumo ir paviršiaus augimo anizotropijos audinių skalėje, išskyrus CZ. Skaičius dešinėje yra Spearmano rho reikšmė tarp dviejų kintamųjų. Žvaigždutės žymi atvejus, kai koreliacijos / neigiamos koreliacijos santykis yra labai reikšmingas. e Col-0 SAM L1 ląstelių 3D vizualizacija konfokalinės mikroskopijos būdu. Naujos ląstelių sienelės, susidariusios SAM (bet ne pradmenyje) po 10 val., yra nuspalvintos pagal jų kampo vertes. Spalvų juosta rodoma apatiniame dešiniajame kampe. Įdėkle parodytas atitinkamas 3D vaizdas 0 val. Eksperimentas buvo pakartotas du kartus, o rezultatai buvo panašūs. f Langelių diagramos rodo ląstelių dalijimosi greitį IPR ir ne IPR Col-0 SAM (n = 10 nepriklausomų augalų). Centrinė linija rodo medianą, o langelių ribos nurodo 25-ąjį ir 75-ąjį procentiles. Ūsai rodo minimalią ir maksimalią vertes, nustatytas naudojant R programinę įrangą. P vertės buvo gautos naudojant Welch dvipusį t-testą. g, h Scheminė diagrama, rodanti (g) kaip išmatuoti naujos ląstelės sienelės kampą (rausvai raudona) radialinės krypties atžvilgiu nuo SAM centro (balta punktyrinė linija) (atsižvelgiama tik į smailiojo kampo vertes, t. y. 0–90°), ir (h) apskritiminę/šoninę ir radialinę kryptis meristemoje. i Ląstelių dalijimosi plokštumos orientacijos dažnio histogramos atitinkamai SAM (tamsiai mėlyna), IPR (vidutiniškai mėlyna) ir ne IPR (šviesiai mėlyna). P reikšmės buvo gautos dvipusiu Kolmogorovo-Smirnovo testu. Eksperimentas buvo pakartotas du kartus, o rezultatai buvo panašūs. j Ląstelių dalijimosi plokštumos orientacijos dažnio histogramos, kuriose pavaizduota IPR orientacija atitinkamai aplink P3 (šviesiai žalia), P4 (vidutiniškai žalia) ir P5 (tamsiai žalia). P reikšmės buvo gautos dvipusiu Kolmogorovo-Smirnovo testu. Eksperimentas buvo pakartotas du kartus, o rezultatai buvo panašūs.
Todėl toliau tyrėme GA signalizacijos ir ląstelių dalijimosi aktyvumo koreliaciją, identifikuodami naujai susiformavusias ląstelių sieneles tyrimo metu (5e pav.). Šis metodas leido mums išmatuoti ląstelių dalijimosi dažnį ir kryptį. Keista, bet nustatėme, kad ląstelių dalijimosi dažnis IP R ir likusioje SAM dalyje (ne IP R, 5f pav.) buvo panašus, o tai rodo, kad GA signalizacijos skirtumai tarp IP R ir ne IP R ląstelių reikšmingai neįtakoja ląstelių dalijimosi. Tai ir teigiama koreliacija tarp GA signalizacijos ir augimo anizotropijos paskatino mus apsvarstyti, ar GA signalizacijos aktyvumas gali turėti įtakos ląstelių dalijimosi plokštumos orientacijai. Išmatuojome naujos ląstelės sienelės orientaciją smailiu kampu radialinės ašies, jungiančios meristemos centrą ir naujos ląstelės sienelės centrą, atžvilgiu (5e-i pav.) ir pastebėjome aiškią ląstelių dalijimosi tendenciją radialinės ašies atžvilgiu, artima 90° kampui, o didžiausi dažniai pastebėti ties 70–80° (23,28 %) ir 80–90° (22,62 %) (5e,i pav.), kas atitinka ląstelių dalijimąsi apskritimo/skersine kryptimi (5h pav.). Norėdami ištirti GA signalizacijos indėlį į šį ląstelių dalijimosi elgseną, atskirai analizavome ląstelių dalijimosi parametrus IPR ir ne IPR (5i pav.). Pastebėjome, kad IP R ląstelių dalijimosi kampo pasiskirstymas skyrėsi nuo ne IP R ląstelių arba viso SAM ląstelių pasiskirstymo, kai IP R ląstelės pasižymėjo didesne šoninių/žiedinių ląstelių dalijimųsi dalimi, t. y. 70–80° ir 80–90° (atitinkamai 33,86 % ir 30,71 %) (5i pav.). Taigi, mūsų stebėjimai atskleidė ryšį tarp didelio GA signalizacijos ir ląstelių dalijimosi plokštumos orientacijos, artimos apskritimo krypčiai, panašiai kaip koreliacija tarp GA signalizacijos aktyvumo ir augimo anizotropijos (5c, d pav.). Siekdami dar labiau patvirtinti šio ryšio erdvinį išsaugojimą, išmatavome dalijimosi plokštumos orientaciją IP R ląstelėse aplink pradmenį, pradedant nuo P3, nes didžiausias GA signalizacijos aktyvumas buvo aptiktas šiame regione, pradedant nuo P4 (4 pav.). IP R dalijimosi kampai aplink P3 ir P4 neparodė statistiškai reikšmingų skirtumų, nors IP R aplink P4 pastebėtas padidėjęs šoninių ląstelių dalijimosi dažnis (5j pav.). Tačiau IP R ląstelėse aplink P5 ląstelių dalijimosi plokštumos orientacijos skirtumas tapo statistiškai reikšmingas, smarkiai padidėjus skersinių ląstelių dalijimosi dažniui (5j pav.). Visi šie rezultatai rodo, kad GA signalizacija gali kontroliuoti ląstelių dalijimosi orientaciją SAM, o tai atitinka ankstesnes ataskaitas40,41, kad didelis GA signalizacijos lygis gali sukelti šoninę ląstelių dalijimosi orientaciją IP R.
Prognozuojama, kad IPR ląstelės nebus įtrauktos į pradmenis, o veikiau į internodus2,42,43. Skersinė ląstelių dalijimosi orientacija IPR gali lemti tipišką lygiagrečių išilginių epidermio ląstelių eilių organizaciją internoduose. Mūsų aprašyti stebėjimai rodo, kad GA signalizacija greičiausiai atlieka svarbų vaidmenį šiame procese, reguliuodama ląstelių dalijimosi kryptį.
Kelių DELLA genų funkcijos praradimas sukelia konstitucinį GA atsaką, o della mutantai gali būti naudojami šiai hipotezei patikrinti44. Pirmiausia išanalizavome penkių DELLA genų raiškos modelius SAM. GUS linijos45 transkripcijos susiliejimas atskleidė, kad GAI, RGA, RGL1 ir RGL2 (daug mažesniu mastu) buvo ekspresuojami SAM (papildomas 11a–d pav.). In situ hibridizacija taip pat parodė, kad GAI mRNR kaupiasi specifiškai pradmenyse ir besivystančiuose žieduose (papildomas 11e pav.). RGL1 ir RGL3 mRNR buvo aptikta visame SAM vainike ir senesniuose žieduose, o RGL2 mRNR buvo gausesnė pasienio regione (papildomas 11f–h pav.). Konfokalinis pRGL3::RGL3-GFP SAM vaizdavimas patvirtino in situ hibridizacijos metu stebėtą raišką ir parodė, kad RGL3 baltymas kaupiasi centrinėje SAM dalyje (papildomas 11i pav.). Naudodami pRGA::GFP-RGA liniją, taip pat nustatėme, kad RGA baltymas kaupiasi SAM, tačiau jo gausa mažėja ties riba, pradedant nuo P4 (papildomas 11j pav.). Pažymėtina, kad RGL3 ir RGA raiškos modeliai atitinka didesnį GA signalizacijos aktyvumą IPR, kaip nustatyta qmRGA (4 pav.). Be to, šie duomenys rodo, kad visos DELLA yra ekspresuojamos SAM ir kad jų raiška bendrai apima visą SAM.
Toliau analizavome ląstelių dalijimosi parametrus laukinio tipo SAM (Ler, kontrolė) ir gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della penkių vienetų (globalūs) mutantai (6a, b pav.). Įdomu tai, kad pastebėjome statistiškai reikšmingą ląstelių dalijimosi kampų dažnių pasiskirstymo pokytį della global mutanto SAM, palyginti su laukiniu tipu (6c pav.). Šis pokytis della global mutante atsirado dėl 80–90° kampų dažnio padidėjimo (34,71 % vs. 24,55 %) ir, mažesniu mastu, 70–80° kampų dažnio padidėjimo (23,78 % vs. 20,18 %), t. y. atitinkančio skersinius ląstelių dalijimusi (6c pav.). Neskersinių dalijimųsi dažnis (0–60°) taip pat buvo mažesnis della global mutante (6c pav.). Skersinių ląstelių dalijimųsi dažnis buvo reikšmingai padidėjęs della global mutanto SAM (6b pav.). Skersinių ląstelių dalijimosi dažnis IPR regione taip pat buvo didesnis della global mutante, palyginti su laukiniu tipu (6d pav.). Už IPR regiono ribų laukinis tipas turėjo tolygesnį ląstelių dalijimosi kampų pasiskirstymą, o della global mutantas pirmenybę teikė tangentiniams dalijimams, kaip ir IPR (6e pav.). Taip pat kiekybiškai įvertinome ląstelių dalijimosi orientaciją ga2 oksidazės (ga2ox) penkių mutantų (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 ir ga2ox6-2) SAM – GA neaktyvaus mutanto fone, kuriame kaupiasi GA. Kartu su GA lygių padidėjimu, penkiagubo ga2ox mutanto žiedyno SAM buvo didesnis nei Col-0 (papildomas 12a, b pav.), ir, palyginti su Col-0, penkiagubas ga2ox SAM parodė ryškiai skirtingą ląstelių dalijimosi kampų pasiskirstymą, kampų dažniui didėjant nuo 50° iki 90°, t. y. vėlgi palankesnis tangentinis dalijimasis (papildomas 12a–c pav.). Taigi, parodome, kad konstitucinis GA signalizacijos aktyvavimas ir GA kaupimasis sukelia šoninį ląstelių dalijimąsi IPR ir likusioje SAM dalyje.
a, b PI dažyto Ler (a) ir globalaus della mutanto (b) SAM L1 sluoksnio 3D vizualizacija naudojant konfokalinę mikroskopiją. Parodytos naujos ląstelių sienelės, susiformavusios SAM (bet ne pradmenyje) per 10 val. laikotarpį, ir nuspalvintos pagal jų kampų vertes. Įdėkle parodyta SAM 0 val. Spalvų juosta rodoma apatiniame dešiniajame kampe. Rodyklė (b) rodo sulygiuotų ląstelių failų pavyzdį globalaus della mutanto atveju. Eksperimentas buvo pakartotas du kartus, o rezultatai buvo panašūs. ce ląstelių dalijimosi plokštumos orientacijų dažnio pasiskirstymo palyginimas visame SAM (d), IPR (e) ir ne IPR (f) tarp Ler ir globalaus della. P vertės buvo gautos naudojant dvipusį Kolmogorovo-Smirnovo testą. f, g PI dažytų Col-0 (i) ir pCUC2::gai-1-VENUS (j) transgeninių augalų SAM konfokalinių vaizdų 3D vizualizacija. Panelėse (a, b) pavaizduotos naujos ląstelių sienelės (bet ne pradmenys), susiformavusios SAM per 10 val. Eksperimentas buvo pakartotas du kartus, rezultatai buvo panašūs. h–j Ląstelių dalijimosi plokštumos orientacijų, esančių visame SAM (h), IPR (i) ir ne IPR (j), dažnio pasiskirstymo palyginimas tarp Col-0 ir pCUC2::gai-1-VENUS augalų. P reikšmės buvo gautos naudojant dvipusį Kolmogorovo-Smirnovo testą.
Toliau išbandėme GA signalizacijos slopinimo poveikį specifiškai IP R. Šiuo tikslu panaudojome sėklaskilčių 2-ojo taurės (CUC2) promotorių, siekdami skatinti dominuojančio neigiamo gai-1 baltymo, sulieto su VENUS (pCUC2::gai-1-VENUS linijoje), ekspresiją. Laukinio tipo SAM CUC2 promotorius skatina daugumos IP R ekspresiją SAM, įskaitant pasienio ląsteles, nuo P4 ir vėlesnių stadijų, ir panaši specifinė ekspresija buvo pastebėta pCUC2::gai-1-VENUS augaluose (žr. toliau). Ląstelių dalijimosi kampų pasiskirstymas pCUC2::gai-1-VENUS augalų SAM arba IP R reikšmingai nesiskyrė nuo laukinio tipo, nors netikėtai pastebėjome, kad ląstelės be IP R šiuose augaluose dalijosi didesniu dažniu – 80–90° (6f–j pav.).
Buvo teigiama, kad ląstelių dalijimosi kryptis priklauso nuo SAM geometrijos, ypač nuo audinio kreivumo sukelto tempimo įtempio46. Todėl klausėme, ar SAM forma pakito della global mutanto ir pCUC2::gai-1-VENUS augaluose. Kaip jau buvo pranešta anksčiau12, della global mutanto SAM dydis buvo didesnis nei laukinio tipo (papildomas 13a, b, d pav.). CLV3 ir STM RNR in situ hibridizacija patvirtino meristemos išsiplėtimą della mutantuose ir dar parodė kamieninių ląstelių nišos šoninį išsiplėtimą (papildomas 13e, f, h, i pav.). Tačiau SAM kreivumas abiejuose genotipuose buvo panašus (papildomas 13k, m, n, p pav.). Panašų dydžio padidėjimą stebėjome gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della keturgubame mutante be kreivumo pokyčio, palyginti su laukiniu tipu (papildomas 13c, d, g, j, l, o, p pav.). Ląstelių dalijimosi orientacijos dažnis taip pat buvo paveiktas della keturgubame mutante, bet mažesniu mastu nei della monolitiniame mutante (papildomas 12d–f pav.). Šis dozės poveikis kartu su poveikio kreivumui nebuvimu rodo, kad liekamasis RGL3 aktyvumas Della keturgubame mutante riboja ląstelių dalijimosi orientacijos pokyčius, kuriuos sukelia DELLA aktyvumo praradimas, ir kad šoninių ląstelių dalijimosi pokyčiai atsiranda reaguojant į GA signalizacijos aktyvumo pokyčius, o ne į SAM geometrijos pokyčius. Kaip aprašyta aukščiau, CUC2 promotorius skatina IPR ekspresiją SAM, pradedant nuo P4 (papildomas 14a, b pav.), ir, priešingai, pCUC2::gai-1-VENUS SAM buvo mažesnio dydžio, bet didesnio kreivumo (papildomas 14c–h pav.). Šis pCUC2::gai-1-VENUS SAM morfologijos pokytis gali lemti skirtingą mechaninių įtempių pasiskirstymą, palyginti su laukiniu tipu, kuriame dideli apskritiminiai įtempiai prasideda mažesniu atstumu nuo SAM centro47. Arba pCUC2::gai-1-VENUS SAM morfologijos pokyčiai gali atsirasti dėl transgeno ekspresijos sukeltų regioninių mechaninių savybių pokyčių48. Abiem atvejais tai galėtų iš dalies kompensuoti GA signalizacijos pokyčių poveikį, padidindama tikimybę, kad ląstelės dalysis apskritimo / skersine orientacija, ir tai paaiškina mūsų stebėjimus.
Apibendrinus, mūsų duomenys patvirtina, kad didesnis GA signalizacijos lygis vaidina aktyvų vaidmenį ląstelės dalijimosi plokštumos šoninėje orientacijoje IPR. Jie taip pat rodo, kad meristemos kreivumas taip pat turi įtakos ląstelės dalijimosi plokštumos orientacijai IPR.
Dėl didelio GA signalizacijos aktyvumo IPR dalijimosi plokštumos skersinė orientacija rodo, kad GA iš anksto suorganizuoja radialinį ląstelių failą epidermyje SAM viduje, kad apibrėžtų ląstelių organizaciją, kuri vėliau bus randama epidermio internabe. Iš tiesų, tokie ląstelių failai dažnai buvo matomi della global mutantų SAM vaizduose (6b pav.). Taigi, norėdami toliau tirti GA signalizacijos erdvinio modelio vystymosi funkciją SAM, panaudojome laiko intervalo vaizdavimą, kad išanalizuotume ląstelių erdvinę organizaciją IPR laukinio tipo (Ler ir Col-0), della global mutantų ir pCUC2::gai-1-VENUS transgeniniuose augaluose.
Nustatėme, kad qmRGA parodė, jog GA signalizacijos aktyvumas IP R padidėjo nuo P1/P2 ir pasiekė piką ties P4, ir šis modelis laikui bėgant išliko pastovus (4a–f pav. ir papildomas 8c–f, k pav.). Norėdami išanalizuoti ląstelių erdvinę organizaciją IP R didėjant GA signalui, pažymėjome Ler IP R ląsteles virš ir į P4 pagal jų vystymosi likimą, analizuotą praėjus 34 val. po pirmojo stebėjimo, t. y. daugiau nei du plastidės kartus, tai leido mums sekti IP R ląsteles pradmens vystymosi metu nuo P1/P2 iki P4. Naudojome tris skirtingas spalvas: geltoną toms ląstelėms, kurios buvo integruotos į pradmenį šalia P4, žalią toms, kurios buvo IP R, ir violetinę toms, kurios dalyvavo abiejuose procesuose (7a–c pav.). Ties t0 (0 val.) priešais P4 buvo matomi 1–2 IP R ląstelių sluoksniai (7a pav.). Kaip ir tikėtasi, kai šios ląstelės dalijosi, jos tai darė daugiausia per skersinę dalijimosi plokštumą (7a–c pav.). Panašūs rezultatai gauti naudojant Col-0 SAM (daugiau dėmesio skiriant P3, kurio kraštinė raukšlėjasi panašiai kaip P4 Ler gene), nors šiame genotipe žiedo krašte susidariusi raukšlė greičiau paslėpė IPR ląsteles (7g–i pav.). Taigi, IPR ląstelių dalijimosi modelis iš anksto organizuoja ląsteles į radialines eiles, kaip ir tarpbamblius. Radialinių eilučių organizacija ir IPR ląstelių lokalizacija tarp vienas po kito einančių organų rodo, kad šios ląstelės yra tarpbamblių pirmtakai.
Čia sukūrėme ratiometrinį GA signalizacijos biosensorių – qmRGA, kuris leidžia kiekybiškai kartografuoti GA signalizacijos aktyvumą, atsirandantį dėl kombinuotų GA ir GA receptorių koncentracijų, tuo pačiu sumažinant trukdžius endogeniniams signalizacijos keliams, taip pateikiant informaciją apie GA funkciją ląstelių lygmeniu. Šiuo tikslu sukūrėme modifikuotą DELLA baltymą – mRGA, kuris prarado gebėjimą jungtis prie DELLA sąveikos partnerių, bet išlieka jautrus GA sukeltai proteolizei. qmRGA reaguoja tiek į egzogeninius, tiek į endogeninius GA lygių pokyčius, o jo dinaminės jutimo savybės leidžia įvertinti erdvėlaikio ir GA signalizacijos aktyvumo pokyčius vystymosi metu. qmRGA taip pat yra labai lanksti priemonė, nes ją galima pritaikyti prie skirtingų audinių, keičiant jo ekspresijai naudojamą promotorių (jei reikia), o atsižvelgiant į konservatyvų GA signalizacijos kelio ir PFYRE motyvo pobūdį gaubtasėkliuose, tikėtina, kad ją bus galima perduoti kitoms rūšims22. Atsižvelgiant į tai, buvo įrodyta, kad lygiavertė ryžių SLR1 DELLA baltymo (HYY497AAA) mutacija slopina SLR1 augimo represoriaus aktyvumą, tuo pačiu tik šiek tiek sumažindama jo GA sukeltą degradaciją, panašiai kaip mRGA23. Pažymėtina, kad naujausi Arabidopsis tyrimai parodė, jog vienos aminorūgšties mutacija PFYRE domene (S474L) pakeitė RGA transkripcijos aktyvumą, nepaveikdama jo gebėjimo sąveikauti su transkripcijos faktorių partneriais50. Nors ši mutacija yra labai artima 3 aminorūgščių pakeitimams, esantiems mRGA, mūsų tyrimai rodo, kad šios dvi mutacijos keičia skirtingas DELLA savybes. Nors dauguma transkripcijos faktorių partnerių jungiasi prie DELLA26,51 LHR1 ir SAW domenų, kai kurios konservuotos aminorūgštys PFYRE domene gali padėti stabilizuoti šias sąveikas.
Tarpubamblių vystymasis yra pagrindinis augalo architektūros ir derliaus gerinimo bruožas. qmRGA atskleidė didesnį GA signalizacijos aktyvumą IPR tarpubamblių pirmtakų ląstelėse. Derindami kiekybinį vaizdinimą ir genetiką, parodėme, kad GA signalizacijos modeliai SAM epidermyje uždeda apskritas/skersines ląstelių dalijimosi plokštumas, formuodami ląstelių dalijimosi organizaciją, reikalingą tarpubamblių vystymuisi. Vystymosi metu buvo nustatyti keli ląstelių dalijimosi plokštumos orientacijos reguliatoriai52,53. Mūsų darbas pateikia aiškų pavyzdį, kaip GA signalizacijos aktyvumas reguliuoja šį ląstelės parametrą. DELLA gali sąveikauti su iš anksto sulankstomais baltymų kompleksais41, todėl GA signalizacija gali reguliuoti ląstelių dalijimosi plokštumos orientaciją tiesiogiai veikdama žievės mikrovamzdelių orientaciją40,41,54,55. Netikėtai parodėme, kad SAM atveju didesnio GA signalizacijos aktyvumo koreliatas buvo ne ląstelių pailgėjimas ar dalijimasis, o tik augimo anizotropija, kuri atitinka tiesioginį GA poveikį ląstelių dalijimosi krypčiai IPR. Tačiau negalime atmesti galimybės, kad šis poveikis taip pat gali būti netiesioginis, pavyzdžiui, tarpininkaujant GA sukeltam ląstelių sienelių suminkštėjimui56. Ląstelės sienelės savybių pokyčiai sukelia mechaninį įtempį57,58, kuris taip pat gali turėti įtakos ląstelės dalijimosi plokštumos orientacijai, paveikdamas žievės mikrovamzdelių orientaciją39,46,59. Bendras GA sukelto mechaninio įtempio ir tiesioginio mikrovamzdelių orientacijos reguliavimo GA poveikis gali būti susijęs su specifinio ląstelių dalijimosi orientacijos modelio sukūrimu IPR, siekiant apibrėžti internodus, ir norint patikrinti šią idėją, reikia atlikti tolesnius tyrimus. Panašiai ankstesni tyrimai pabrėžė DELLA sąveikaujančių baltymų TCP14 ir 15 svarbą kontroliuojant internodų formavimąsi60,61, ir šie veiksniai gali tarpininkauti GA veikimui kartu su BREVIPEDICELLUS (BP) ir PENNYWISE (PNY), kurie reguliuoja internodų vystymąsi ir, kaip įrodyta, daro įtaką GA signalizacijai2,62. Atsižvelgiant į tai, kad DELLA sąveikauja su brassinosteroidų, etileno, jazmono rūgšties ir abscizinės rūgšties (ABA) signalizacijos keliais63,64 ir kad šie hormonai gali turėti įtakos mikrovamzdelių orientacijai65, GA poveikį ląstelių dalijimosi orientacijai taip pat gali tarpininkauti kiti hormonai.
Ankstyvieji citologiniai tyrimai parodė, kad tiek vidinis, tiek išorinis Arabidopsis SAM regionai yra būtini internodų vystymuisi2,42. Tai, kad GA aktyviai reguliuoja ląstelių dalijimąsi vidiniuose audiniuose12, patvirtina dvigubą GA funkciją reguliuojant meristemos ir internodų dydį SAM. Kryptingo ląstelių dalijimosi modelis taip pat yra griežtai reguliuojamas vidiniame SAM audinyje, ir šis reguliavimas yra būtinas stiebo augimui52. Bus įdomu ištirti, ar GA taip pat atlieka vaidmenį orientuojant ląstelių dalijimosi plokštumą vidinėje SAM organizacijoje, tokiu būdu sinchronizuodamas internodų specifikaciją ir vystymąsi SAM viduje.
Augalai buvo auginami in vitro dirvožemyje arba 1x Murashige-Skoog (MS) terpėje („Duchefa“), papildytoje 1 % sacharozės ir 1 % agaro („Sigma“), standartinėmis sąlygomis (16 val. šviesos, 22 °C), išskyrus hipokotilo ir šaknų augimo eksperimentus, kuriuose daigai buvo auginami vertikaliose lėkštelėse esant pastoviai šviesai ir 22 °C temperatūrai. Nitratų eksperimentams augalai buvo auginami modifikuotoje MS terpėje („bioWORLD“ augalų terpė), papildytoje tinkamu nitratų kiekiu (0 arba 10 mM KNO3), 0,5 mM NH4-sukcinatu, 1 % sacharozės ir 1 % A-agaro („Sigma“), ilgos dienos sąlygomis.
Į pDONR221 įterpta GID1a cDNR buvo rekombinuota su pDONR P4-P1R-pUBQ10 ir pDONR P2R-P3-mCherry į pB7m34GW, kad būtų gautas pUBQ10::GID1a-mCherry. Į pDONR221 įterpta IDD2 DNR buvo rekombinuota su pB7RWG266, kad būtų gautas p35S:IDD2-RFP. Norint sugeneruoti pGID1b::2xmTQ2-GID1b, pirmiausia buvo amplifikuotas 3,9 kb fragmentas prieš GID1b koduojantį regioną ir 4,7 kb fragmentas, kuriame yra GID1b cDNR (1,3 kb) ir terminatorius (3,4 kb), naudojant 3 papildomoje lentelėje pateiktus pradmenis, o po to įterptas atitinkamai į pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) ir pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific) ir galiausiai rekombinuotas su pDONR221 2xmTQ268 į pGreen 012567 taikinio vektorių naudojant „Gateway“ klonavimą. Norint gauti pCUC2::LSSmOrange, CUC2 promotoriaus seka (3229 bp prieš ATG), po kurios seka didelio Stokso poslinkio mOrange (LSSmOrange)69 koduojanti seka su N7 branduolio lokalizacijos signalu ir NOS transkripcijos terminatoriumi, naudojant „Gateway 3-fragment rekombinacijos sistemą“ (Invitrogen), buvo surinktos į pGreen kanamicino taikinio vektorių. Augalinis dvejetainis vektorius buvo įvestas į Agrobacterium tumefaciens padermę GV3101, į Nicotiana benthamiana lapus Agrobacterium infiltracijos metodu ir į Arabidopsis thaliana Col-0 žiedų mirkymo metodu. pUBQ10::qmRGA, pUBQ10::GID1a-mCherry ir pCLV3::mCherry-NLS qmRGA buvo išskirti atitinkamai iš F3 ir F1 palikuonių iš atitinkamų kryžminimų.
RNR in situ hibridizacija buvo atlikta su maždaug 1 cm ilgio ūglių galiukais72, kurie buvo surinkti ir nedelsiant fiksuoti FAA tirpale (3,7 % formaldehido, 5 % acto rūgšties, 50 % etanolio), atšaldytame iki 4 °C. Po 2 × 15 min. vakuuminio apdorojimo fiksatorius buvo pakeistas ir mėginiai inkubuoti per naktį. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 ir RGL3 kDNR ir antisensiniai zondai jų 3′-UTR buvo susintetinti naudojant 3 papildomoje lentelėje pateiktus pradmenis, kaip aprašė Rosier ir kt.73. Digoksigeninu žymėti zondai buvo imunodetektuoti naudojant digoksigenino antikūnus (3000 kartų praskiedimas; „Roche“, katalogo numeris: 11 093 274 910), o pjūviai buvo nudažyti 5-brom-4-chlor-3-indolilfosfato (BCIP, 250 kartų praskiedimas) / nitroblue tetrazolium (NBT, 200 kartų praskiedimas) tirpalu.
Įrašo laikas: 2025 m. vasario 10 d.