Šiame tyrime stimuliuojantis kombinuoto gydymo poveikisaugalų augimo reguliatoriaiBuvo tirtas (2,4-D ir kinetino) bei geležies oksido nanodalelių (Fe₃O₄-NP) poveikis in vitro morfogenezei ir antrinių metabolitų gamybai *Hypericum perforatum* L. augaluose. Optimizuotas apdorojimas [2,4-D (0,5 mg/l) + kinetinas (2 mg/l) + Fe₃O₄-NP (4 mg/l)] reikšmingai pagerino augalų augimo parametrus: augalo aukštis padidėjo 59,6 %, šaknų ilgis – 114,0 %, pumpurų skaičius – 180,0 %, o kaliaus šviežioji masė – 198,3 %, palyginti su kontroline grupe. Šis kombinuotas apdorojimas taip pat padidino regeneracijos efektyvumą (50,85 %) ir padidino hipericino kiekį 66,6 %. GC-MS analizė parodė didelį hiperozido, β-patoleno ir cetilo alkoholio kiekį, kuris sudarė 93,36 % bendro smailės ploto, o bendras fenolių ir flavonoidų kiekis padidėjo net 80,1 %. Šie rezultatai rodo, kad augalų augimo reguliatoriai (PGR) ir Fe₃O₄ nanodalelės (Fe₃O₄-NP) daro sinergetinį poveikį, stimuliuodami organogenezę ir bioaktyviųjų junginių kaupimąsi, o tai yra perspektyvi vaistinių augalų biotechnologinio tobulinimo strategija.
Jonažolė (Hypericum perforatum L.), dar žinoma kaip jonažolė, yra daugiametis žolinis augalas, priklausantis jonažolės (Hypericaceae) šeimai, turintis ekonominę vertę.[1] Jos potencialūs bioaktyvūs komponentai yra natūralūs taninai, ksantonai, florogliucinolis, naftalenidiantronas (hiperinas ir pseudohiperinas), flavonoidai, fenolio rūgštys ir eteriniai aliejai.[2,3,4] Jonažolė gali būti dauginama tradiciniais metodais; tačiau tradicinių metodų sezoniškumas, mažas sėklų daigumas ir jautrumas ligoms riboja jos galimybes plačiai auginti ir nuolat formuotis antriniams metabolitams.[1,5,6]
Taigi, audinių kultūra in vitro laikoma veiksmingu metodu greitam augalų dauginimui, gemalo išteklių išsaugojimui ir vaistinių junginių derliaus padidinimui [7, 8]. Augalų augimo reguliatoriai (AGR) atlieka labai svarbų vaidmenį reguliuojant morfogenezę ir yra būtini kaliusų ir ištisų organizmų auginimui in vitro. Jų koncentracijų ir derinių optimizavimas yra labai svarbus norint sėkmingai užbaigti šiuos vystymosi procesus [9]. Todėl norint pagerinti jonažolių (H. perforatum) augimą ir regeneracinį pajėgumą, svarbu suprasti tinkamą reguliatorių sudėtį ir koncentraciją [10].
Geležies oksido nanodalelės (Fe₃O₄) yra nanodalelių klasė, kuri buvo arba yra kuriama audinių kultūroms. Fe₃O₂ pasižymi reikšmingomis magnetinėmis savybėmis, geru biologiniu suderinamumu ir gebėjimu skatinti augalų augimą bei mažinti aplinkos stresą, todėl sulaukė didelio dėmesio audinių kultūrų projektavime. Galimos šių nanodalelių taikymo sritys gali apimti in vitro kultūros optimizavimą, siekiant skatinti ląstelių dalijimąsi, pagerinti maistinių medžiagų įsisavinimą ir aktyvuoti antioksidacinius fermentus [11].
Nors nanodalelės parodė gerą skatinamąjį poveikį augalų augimui, tyrimų apie kombinuotą Fe₃O₄ nanodalelių ir optimizuotų augalų augimo reguliatorių naudojimą *H. perforatum* vis dar trūksta. Siekiant užpildyti šią žinių spragą, šiame tyrime buvo įvertintas jų bendro poveikio poveikis in vitro morfogenezei ir antrinių metabolitų gamybai, siekiant pateikti naujų įžvalgų, kaip pagerinti vaistinių augalų savybes. Todėl šis tyrimas turi du tikslus: (1) optimizuoti augalų augimo reguliatorių koncentraciją, kad būtų veiksmingai skatinamas kaliaus formavimasis, ūglių regeneracija ir įsišaknijimas in vitro; ir (2) įvertinti Fe₃O₄ nanodalelių poveikį augimo parametrams in vitro. Ateities planai apima regeneruotų augalų išgyvenamumo įvertinimą aklimatizacijos metu (in vitro). Tikimasi, kad šio tyrimo rezultatai žymiai pagerins *H. perforatum* mikrodauginimo efektyvumą, taip prisidėdami prie tvaraus šio svarbaus vaistinio augalo naudojimo ir biotechnologinių pritaikymų.
Šiame tyrime gavome lauke auginamų vienmečių jonažolių (motininių augalų) lapų eksplantus. Šie eksplantai buvo naudojami in vitro kultūros sąlygoms optimizuoti. Prieš kultivavimą lapai buvo kruopščiai nuplauti po tekančiu distiliuotu vandeniu kelias minutes. Eksplantų paviršiai buvo dezinfekuojami panardinant juos į 70 % etanolį 30 sekundžių, po to 10 minučių panardinant į 1,5 % natrio hipochlorito (NaOCl) tirpalą, kuriame buvo keli lašai „Tween 20“. Galiausiai, eksplantai buvo tris kartus nuplauti steriliu distiliuotu vandeniu, prieš perkeliant į kitą kultūros terpę.
Per kitas keturias savaites buvo matuojami ūglių regeneracijos parametrai, įskaitant regeneracijos greitį, ūglių skaičių viename eksplante ir ūglio ilgį. Kai regeneruoti ūgliai pasiekė bent 2 cm ilgį, jie buvo perkelti į įsišaknijimo terpę, sudarytą iš pusiau koncentruotos MS terpės, 0,5 mg/l indolesviesto rūgšties (IBA) ir 0,3 % guaro dervos. Įsišaknijimo kultivavimas tęsėsi tris savaites, per tą laiką buvo matuojamas įsišaknijimo greitis, šaknų skaičius ir šaknų ilgis. Kiekvienas apdorojimas buvo pakartotas tris kartus, kiekviename pakartojime kultivuojant 10 eksplantų, gaunant maždaug 30 eksplantų iš kiekvieno apdorojimo.
Augalo aukštis buvo matuojamas centimetrais (cm) naudojant liniuotę, nuo augalo pagrindo iki aukščiausio lapo viršūnės. Šaknų ilgis buvo matuojamas milimetrais (mm) iš karto po to, kai atsargiai pašalinami daigai ir auginimo substratas. Pumpurų skaičius viename eksplante buvo suskaičiuotas tiesiai ant kiekvieno augalo. Juodų dėmių, vadinamų mazgeliais, skaičius ant lapų buvo matuojamas vizualiai. Manoma, kad šie juodi mazgeliai yra liaukos, kuriose yra hipericino, arba oksidacinės dėmės, ir naudojami kaip fiziologinis augalo reakcijos į apdorojimą rodiklis. Pašalinus visą auginimo substratą, šviežias daigų svoris buvo matuojamas elektroninėmis svarstyklėmis, kurių tikslumas yra miligramai (mg).
Kaluso susidarymo greitis apskaičiuojamas taip: po keturių savaičių eksplantų kultivavimo terpėje, kurioje yra įvairių augimo reguliatorių (kinazių, 2,4-D ir Fe3O4), suskaičiuojamas eksplantų, galinčių suformuoti kaliusą, skaičius. Kaluso susidarymo greičio apskaičiavimo formulė yra tokia:
Kiekvienas apdorojimas buvo pakartotas tris kartus, kiekvieno pakartojimo metu ištiriant bent 10 eksplantų.
Regeneracijos greitis atspindi kaluso audinio dalį, kuri sėkmingai užbaigia pumpurų diferenciacijos procesą po kaluso formavimosi etapo. Šis rodiklis parodo kaluso audinio gebėjimą transformuotis į diferencijuotą audinį ir išaugti į naujus augalo organus.
Įsišaknijimo koeficientas yra šakų, galinčių įsišaknyti, skaičiaus ir bendro šakų skaičiaus santykis. Šis rodiklis atspindi įsišaknijimo stadijos sėkmę, kuri yra labai svarbi mikrodauginimui ir augalų dauginimui, nes geras įsišaknijimas padeda daigams geriau išgyventi augimo sąlygomis.
Hipericino junginiai buvo ekstrahuoti 90 % metanolio tirpalu. Penkiasdešimt mg džiovintos augalinės medžiagos buvo įdėta į 1 ml metanolio ir 20 min. sonikuota ultragarsiniame valytuve (A5120-3YJ modelis) kambario temperatūroje, tamsoje, esant 30 kHz dažniui. Po sonikacijos mėginys buvo centrifuguotas 6000 aps./min. greičiu 15 min. Supernatantas buvo surinktas, o hipericino absorbcija buvo matuojama esant 592 nm bangos ilgiui, naudojant Plus-3000 S spektrofotometrą pagal Conceiçao ir kt. [14] aprašytą metodą.
Dauguma apdorojimo būdų su augalų augimo reguliatoriais (AGR) ir geležies oksido nanodalelėmis (Fe₃O₄-NP) nesukėlė juodų mazgelių susidarymo ant regeneruotų ūglių lapų. Mazgelių nepastebėta nė viename iš apdorojimo būdų su 0,5 arba 1 mg/l 2,4-D, 0,5 arba 1 mg/l kinetino arba 1, 2 arba 4 mg/l geležies oksido nanodalelių. Keli deriniai parodė nedidelį mazgelių vystymosi padidėjimą (tačiau statistiškai nereikšmingą) esant didesnėms kinetino ir (arba) geležies oksido nanodalelių koncentracijoms, pavyzdžiui, 2,4-D (0,5–2 mg/l) derinį su kinetinu (1–1,5 mg/l) ir geležies oksido nanodalelėmis (2–4 mg/l). Šie rezultatai pateikti 2 paveiksle. Juodi mazgeliai rodo natūraliai susidarančias ir naudingas hipericino turinčias liaukas. Šiame tyrime juodi mazgeliai daugiausia buvo susiję su audinių rudėjimu, rodančiu palankią aplinką hipericino kaupimuisi. Apdorojimas 2,4-D, kinetinu ir Fe₃O₄ nanodalelėmis skatino kaliaus augimą, sumažino rudėjimą ir padidino chlorofilo kiekį, o tai rodo pagerėjusią metabolinę funkciją ir galimą oksidacinės žalos sumažėjimą [37]. Šiame tyrime buvo vertinamas kinetino, vartojamo kartu su 2,4-D ir Fe₃O₄ nanodalelėmis, poveikis jonažolės kaliaus augimui ir vystymuisi (3a–g pav.). Ankstesni tyrimai parodė, kad Fe₃O₄ nanodalelės pasižymi priešgrybeliniu ir antimikrobiniu poveikiu [38, 39] ir, naudojamos kartu su augalų augimo reguliatoriais, gali stimuliuoti augalų apsaugos mechanizmus ir sumažinti ląstelių streso rodiklius [18]. Nors antrinių metabolitų biosintezė yra reguliuojama genetiškai, jų faktinis derlius labai priklauso nuo aplinkos sąlygų. Metaboliniai ir morfologiniai pokyčiai gali turėti įtakos antrinių metabolitų kiekiui, reguliuodami specifinių augalų genų ekspresiją ir reaguodami į aplinkos veiksnius. Be to, induktoriai gali sukelti naujų genų aktyvaciją, o tai savo ruožtu stimuliuoja fermentinį aktyvumą, galiausiai aktyvuodami daugybę biosintezės kelių ir sukeldami antrinių metabolitų susidarymą. Be to, kitas tyrimas parodė, kad sumažinus šešėliavimą, padidėja saulės šviesos poveikis, todėl natūralioje *Hypericum perforatum* buveinėje dienos metu pakyla temperatūra, o tai taip pat prisideda prie padidėjusio hipericino derliaus. Remiantis šiais duomenimis, šiame tyrime buvo tiriamas geležies nanodalelių, kaip potencialių induktorių, vaidmuo audinių kultūroje. Rezultatai parodė, kad šios nanodalelės gali aktyvuoti hesperidino biosintezėje dalyvaujančius genus per fermentinę stimuliaciją, todėl padidėja šio junginio kaupimasis (2 pav.). Todėl, palyginti su natūraliomis sąlygomis augančiais augalais, galima teigti, kad tokių junginių gamyba in vivo taip pat gali būti padidinta, kai vidutinis stresas derinamas su genų, dalyvaujančių antrinių metabolitų biosintezėje, aktyvacija. Kombinuotas gydymas paprastai teigiamai veikia regeneracijos greitį, tačiau kai kuriais atvejais šis poveikis susilpnėja. Pažymėtina, kad gydymas 1 mg/l 2,4-D, 1,5 mg/l kinazės ir skirtingomis koncentracijomis gali nepriklausomai ir reikšmingai padidinti regeneracijos greitį 50,85 %, palyginti su kontroline grupe (4c pav.). Šie rezultatai rodo, kad specifiniai nanohormonų deriniai gali sinergiškai skatinti augalų augimą ir metabolitų gamybą, o tai yra labai svarbu vaistinių augalų audinių kultūrai. Palmer ir Keller [50] parodė, kad 2,4-D apdorojimas gali savarankiškai sukelti kaluso formavimąsi St. perforatum, o kinazės pridėjimas žymiai sustiprino kaluso formavimąsi ir regeneraciją. Šis poveikis atsirado dėl hormonų pusiausvyros pagerėjimo ir ląstelių dalijimosi stimuliavimo. Bal ir kt. [51] nustatė, kad Fe₃O₄-NP apdorojimas gali savarankiškai sustiprinti antioksidacinių fermentų funkciją, taip skatindamas St. perforatum šaknų augimą. Kultūros terpės, kuriose yra Fe₃O₄ nanodalelių, kurių koncentracija yra 0,5 mg/l, 1 mg/l ir 1,5 mg/l, pagerino linų augalų regeneracijos greitį [52]. Kinetino, 2,4-dichlorbenzotiazolinono ir Fe₃O₄ nanodalelių naudojimas žymiai pagerino kaluso ir šaknų formavimosi greitį, tačiau reikia atsižvelgti į galimą šių hormonų naudojimo regeneracijai in vitro šalutinį poveikį. Pavyzdžiui, ilgalaikis arba didelės koncentracijos 2,4-dichlorbenzotiazolinono arba kinetino naudojimas gali sukelti somatinę kloninę variaciją, oksidacinį stresą, nenormalią kaliaus morfologiją arba vitrifikaciją. Todėl didelis regeneracijos greitis nebūtinai numato genetinį stabilumą. Visi regeneruoti augalai turėtų būti įvertinti naudojant molekulinius žymenis (pvz., RAPD, ISSR, AFLP) arba citogenetinę analizę, siekiant nustatyti jų homogeniškumą ir panašumą į in vivo augalus [53,54,55].
Šis tyrimas pirmą kartą parodė, kad augalų augimo reguliatorių (2,4-D ir kinetino) derinys su Fe₃O₄ nanodalelėmis gali sustiprinti morfogenezę ir pagrindinių bioaktyviųjų metabolitų (įskaitant hipericiną ir hiperozidą) kaupimąsi *Hypericum perforatum*. Optimizuotas gydymo režimas (1 mg/l 2,4-D + 1 mg/l kinetino + 4 mg/l Fe₃O₄-NP) ne tik maksimaliai padidino kaliaus formavimąsi, organogenezę ir antrinių metabolitų išeigą, bet ir parodė silpną indukuojantį poveikį, potencialiai pagerinantį augalo atsparumą stresui ir medicininę vertę. Nanotechnologijų ir augalų audinių kultūros derinys suteikia tvarią ir efektyvią platformą didelio masto vaistinių junginių gamybai in vitro. Šie rezultatai atveria kelią pramoniniam pritaikymui ir būsimiems molekulinių mechanizmų, dozavimo optimizavimo ir genetinio tikslumo tyrimams, taip susiejant fundamentinius vaistinių augalų tyrimus su praktine biotechnologija.
Įrašo laikas: 2025 m. gruodžio 12 d.