paklausimasg

Anthelmintinis vaistas N, N-dietil-m-toluamidas (DEET) sukelia angiogenezę per alosterinį muskarininių M3 receptorių moduliavimą endotelio ląstelėse.

  
Antihelmintinis vaistas N,N-dietil-m-toluamidas (DEETBuvo pranešta, kad ) slopina AChE (acetilcholinesterazę) ir dėl pernelyg didelės vaskuliarizacijos gali sukelti kancerogeninių savybių. Šiame darbe parodome, kad DEET specifiškai stimuliuoja endotelio ląsteles, kurios skatina angiogenezę, taip padidindamos naviko augimą. DEET aktyvina ląstelių procesus, sukeliančius angiogenezę, įskaitant proliferaciją, migraciją ir adheziją. Tai siejama su padidėjusia NO gamyba ir VEGF ekspresija endotelio ląstelėse. M3 nutildymas arba farmakologinių M3 inhibitorių naudojimas panaikino visus šiuos efektus, o tai rodo, kad DEET sukelta angiogenezė yra jautri M3. Eksperimentai, susiję su kalcio signalizavimu endotelio ir HEK ląstelėse, kurios per daug ekspresuoja M3 receptorius, taip pat surišimo ir prijungimo tyrimai rodo, kad DEET veikia kaip allosterinis M3 receptorių moduliatorius. Be to, DEET slopina AChE, taip padidindamas acetilcholino biologinį prieinamumą ir jo prisijungimą prie M3 receptorių bei sustiprindamas proangiogeninį poveikį per alosterinį reguliavimą.
Pirminės EC buvo išskirtos iš Šveicarijos pelių aortos. Ekstrahavimo metodas buvo pritaikytas iš Kobayashi protokolo 26 . Pelių EC buvo kultivuojamos EBM-2 terpėje, papildytoje 5% termiškai inaktyvuotu FBS iki ketvirto pasėjimo.
Dviejų koncentracijų DEET poveikis HUVEC, U87MG arba BF16F10 proliferacijai buvo analizuojamas naudojant CyQUANT ląstelių proliferacijos tyrimo rinkinį (Molecular Probes, C7026). Trumpai tariant, 5, 103 ląstelės viename šulinyje buvo pasėtos į 96 šulinėlių plokštelę, leista prisitvirtinti per naktį ir po to 24 valandas apdorotos DEET. Išėmę auginimo terpę, į kiekvieną mikroplokštelės šulinėlį įpilkite dažų surišimo tirpalo ir 30 min inkubuokite ląsteles 37 °C temperatūroje. Fluorescencijos lygiai buvo nustatyti naudojant Mithras LB940 daugiamodį mikroplokštelių skaitytuvą (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Vokietija), aprūpintą 485 nm sužadinimo filtrais ir 530 nm emisijos filtrais.
HUVEC buvo sėjami į 96 šulinėlių plokšteles, kurių tankis buvo 104 ląstelės vienoje duobutėje. Ląstelės buvo apdorotos DEET 24 valandas. Ląstelių gyvybingumas buvo įvertintas naudojant kolorimetrinį MTT tyrimą (Sigma-Aldrich, M5655). Optinio tankio vertės buvo gautos naudojant daugiamodį mikroplokštelių skaitytuvą (Mithras LB940), esant 570 nm bangos ilgiui.
DEET poveikis buvo tiriamas naudojant in vitro angiogenezės tyrimus. Gydymas 10-8 M arba 10-5 M DEET padidino kapiliarų ilgio susidarymą HUVEC (1a, b pav., baltos juostos). Palyginti su kontroline grupe, gydymas DEET koncentracijomis nuo 10–14 iki 10–5 M parodė, kad kapiliarų ilgis pasiekė 10–8 M DEET (papildomas S2 pav.). Nebuvo nustatytas reikšmingas skirtumas tarp HUVEC proangiogeninio poveikio in vitro, apdorotų DEET, kai koncentracija yra 10–8 M ir 10–5 M.
Norėdami nustatyti DEET poveikį neovaskuliarizacijai, atlikome in vivo neovaskuliarizacijos tyrimus. Po 14 dienų pelėms, kurioms buvo sušvirkštos endotelio ląstelės, iš anksto kultivuotos 10–8 M arba 10–5 M DEET, reikšmingai padidėjo hemoglobino kiekis (1c pav., baltos juostos).
Be to, DEET sukelta neovaskuliarizacija buvo tiriama pelėms, turinčioms U87MG ksenografus, kurioms kasdien (ip) buvo švirkščiama DEET dozė, kuri, kaip žinoma, sukelia 10–5 M koncentraciją plazmoje, o tai yra normalu paveiktiems žmonėms. 23. Aptinkami navikai (ty navikai >100 mm3) buvo pastebėti praėjus 14 dienų po U87MG ląstelių injekcijos pelėms. 28 dieną DEET gydytų pelių auglio augimas žymiai sustiprėjo, palyginti su kontrolinėmis pelėmis (1d pav., kvadratai). Be to, navikų dažymas CD31 parodė, kad DEET žymiai padidino kapiliarų plotą, bet ne mikrokraujagyslių tankį. (1e–g pav.).
Norint nustatyti muskarininių receptorių vaidmenį DETA sukeltame proliferacijoje, buvo naudojamas 10-8 M arba 10-5 M DETA, esant pFHHSiD (10-7 M, selektyvus M3 receptorių antagonistas). HUVEC gydymas. pFHHSiD visiškai užblokavo DETA proliferacines savybes visomis koncentracijomis (1 lentelė).
Esant tokioms sąlygoms, mes taip pat ištyrėme, ar DEET padidins kapiliarų ilgį HUVEC ląstelėse. Panašiai pFHHSiD reikšmingai užkirto kelią DEET sukeltam kapiliarų ilgiui (1a, b pav., pilkos juostos). Be to, panašūs eksperimentai buvo atlikti su M3 siRNR. Nors kontrolinė siRNR nebuvo veiksminga skatinant kapiliarų susidarymą, M3 muskarino receptoriaus nutildymas panaikino DEET galimybę padidinti kapiliarų ilgį (1a, b pav., juodos juostos).
Be to, tiek 10-8 M arba 10-5 M DEET sukelta vaskuliarizacija in vitro ir neovaskuliarizacija in vivo buvo visiškai užblokuota pFHHSiD (1c, d pav., apskritimai). Šie rezultatai rodo, kad DEET skatina angiogenezę per kelią, jautrų selektyviems M3 receptorių antagonistams arba M3 siRNR.
AChE yra molekulinis DEET taikinys. Vaistai, tokie kaip donepezilas, kurie veikia kaip AChE inhibitoriai, gali stimuliuoti EB angiogenezę in vitro ir pelių užpakalinių galūnių išemijos modeliuose14. Mes išbandėme dviejų DEET koncentracijų poveikį AChE fermento aktyvumui HUVEC. Mažos (10-8 M) ir didelės (10-5 M) DEET koncentracijos sumažino endotelio AChE aktyvumą lyginant su kontrolinėmis sąlygomis (2 pav.).
Abi DEET koncentracijos (10–8 M ir 10–5 M) sumažino acetilcholinesterazės aktyvumą HUVEC. BW284c51 (10-5 M) buvo naudojamas kaip acetilcholinesterazės inhibitorių kontrolė. Rezultatai išreiškiami procentais AChE aktyvumo HUVEC, apdoroto dviem DEET koncentracijomis, palyginti su nešikliu apdorotomis ląstelėmis. Vertės išreiškiamos kaip šešių nepriklausomų eksperimentų vidurkis ± SEM. *p < 0,05, palyginti su kontroliniu (Kruskal-Wallis ir Dunn daugkartinio palyginimo testas).
Azoto oksidas (NO) dalyvauja angiogeniniame procese 33, todėl buvo tiriama NO gamyba DEET stimuliuojamose HUVEC. DEET apdoroto endotelio NO gamyba padidėjo, lyginant su kontrolinėmis ląstelėmis, bet pasiekė reikšmingumą tik vartojant 10-8 M dozę (3c pav.). Norint nustatyti molekulinius pokyčius, kontroliuojančius DEET sukeltą NO gamybą, eNOS ekspresija ir aktyvacija buvo analizuojama Western blot metodu. Nors gydymas DEET nepakeitė eNOS ekspresijos, jis žymiai padidino eNOS fosforilinimą aktyvinimo vietoje (Ser-1177), tuo pačiu sumažindamas jo slopinimo vietą (Thr-495), palyginti su neapdorotomis eNOS fosforilinimo ląstelėmis (3d pav.). Be to, fosforilinto eNOS santykis aktyvacijos vietoje ir slopinimo vietoje buvo apskaičiuotas normalizavus fosforilinto eNOS kiekį ir bendrą fermento kiekį. Šis santykis žymiai padidėjo HUVEC, apdorotuose kiekviena DEET koncentracija, palyginti su neapdorotomis ląstelėmis (3d pav.).
Galiausiai VEGF, vieno iš pagrindinių proangiogeninių veiksnių, ekspresija buvo ištirta Western blot metodu. DEET žymiai padidino VEGF ekspresiją, o pFHHSiD visiškai užblokavo šią išraišką .
Kadangi DEET poveikis yra jautrus tiek farmakologinei M3 receptorių blokadai, tiek sumažėjusiam reguliavimui, išbandėme hipotezę, kad DEET gali sustiprinti kalcio signalizaciją. Keista, bet DEET nepavyko padidinti citoplazminio kalcio kiekio HUVEC (duomenys nerodomi) ir HEK/M3 (4a, b pav.) abiem naudotoms koncentracijoms.

 

Paskelbimo laikas: 2024-12-30