Antihelmintinis vaistas N,N-dietil-m-toluamidas (DEET) buvo pranešta, kad slopina AChE (acetilcholinesterazę) ir dėl pernelyg didelės vaskuliarizacijos pasižymi potencialiomis kancerogeninėmis savybėmis. Šiame straipsnyje parodome, kad DEET specifiškai stimuliuoja endotelio ląsteles, kurios skatina angiogenezę, taip padidindamas naviko augimą. DEET aktyvina ląstelių procesus, sukeliančius angiogenezę, įskaitant proliferaciją, migraciją ir adheziją. Tai susiję su padidėjusia NO gamyba ir VEGF ekspresija endotelio ląstelėse. M3 nutildymas arba farmakologinių M3 inhibitorių vartojimas panaikino visus šiuos efektus, o tai rodo, kad DEET sukelta angiogenezė yra jautri M3. Eksperimentai, apimantys kalcio signalizaciją endotelio ir HEK ląstelėse, kuriose per daug ekspresuojami M3 receptoriai, taip pat prisijungimo ir jungimosi tyrimai rodo, kad DEET veikia kaip alosterinis M3 receptorių moduliatorius. Be to, DEET slopina AChE, taip padidindamas acetilcholino biologinį prieinamumą ir jo prisijungimą prie M3 receptorių, bei sustiprindamas proangiogeninį poveikį per alosterinę reguliaciją.
Pirminės endotelio ląstelės (EC) buvo išskirtos iš Šveicarijos pelių aortos. Ekstrahavimo metodas buvo adaptuotas pagal Kobayashi protokolą26. Pelių EC buvo kultivuojamos EBM-2 terpėje, papildytoje 5 % karščiu inaktyvuoto FBS, iki ketvirtojo pasažo.
Dviejų DEET koncentracijų poveikis HUVEC, U87MG arba BF16F10 proliferacijai buvo analizuojamas naudojant „CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit“ („Molecular Probes“, C7026). Trumpai tariant, į 96 šulinėlių plokštelę buvo pasėta po 5,103 ląstelių į kiekvieną šulinėlį, leista prisitvirtinti per naktį, o po to 24 valandas apdorota DEET. Pašalinus augimo terpę, į kiekvieną mikroplokštelės šulinėlį įpilkite dažų surišimo tirpalo ir ląstelės inkubuojamos 37 °C temperatūroje 30 min. Fluorescencijos lygiai buvo nustatyti naudojant daugiamodį mikroplokštelių skaitytuvą „Mithras LB940“ („Berthold Technologies“, Bad Wildbadas, Vokietija) su 485 nm sužadinimo filtrais ir 530 nm emisijos filtrais.
HUVEC buvo pasėtos į 96 šulinėlių plokšteles, kurių tankis buvo 104 ląstelės viename šulinėlyje. Ląstelės 24 val. buvo apdorotos DEET. Ląstelių gyvybingumas buvo įvertintas kolorimetriniu MTT tyrimu („Sigma-Aldrich“, M5655). Optinio tankio vertės buvo gautos daugiamodžiu mikroplokštelių skaitytuvu („Mithras LB940“), esant 570 nm bangos ilgiui.
DEET poveikis buvo tirtas naudojant angiogenezės tyrimus in vitro. Gydymas 10-8 M arba 10-5 M DEET padidino kapiliarų ilgio formavimąsi HUVEC (1a, b pav., baltos juostos). Palyginti su kontroline grupe, gydymas DEET koncentracijomis nuo 10-14 iki 10-5 M parodė, kad kapiliarų ilgis pasiekė stabilumą esant 10-8 M DEET (papildomas S2 pav.). Nerasta reikšmingo skirtumo in vitro proangiogeniniame HUVEC poveikyje, gydytame DEET koncentracijų intervale nuo 10-8 M iki 10-5 M.
Norėdami nustatyti DEET poveikį neovaskuliarizacijai, atlikome neovaskuliarizacijos tyrimus in vivo. Po 14 dienų pelėms, kurioms buvo sušvirkštos endotelio ląstelės, iš anksto kultivuotos su 10-8 M arba 10-5 M DEET, pastebimai padidėjo hemoglobino kiekis (1c pav., balti stulpeliai).
Be to, DEET sukelta neovaskuliarizacija buvo tirta U87MG ksenotransplantato turinčioms pelėms, kurioms kasdien (ip) buvo švirkščiama DEET dozė, sukelianti 10-5 M koncentraciją plazmoje, kuri yra normali paveiktiems žmonėms. 23 tyrime. Aptinkami navikai (t. y. navikai >100 mm3) buvo pastebėti praėjus 14 dienų po U87MG ląstelių injekcijos pelėms. 28 dieną navikų augimas DEET gydytose pelėse buvo žymiai padidėjęs, palyginti su kontrolinėmis pelėmis (1d pav., kvadratai). Be to, navikų CD31 dažymas parodė, kad DEET reikšmingai padidino kapiliarų plotą, bet ne mikrokraujagyslių tankį. (1e–g pav.)
Norint nustatyti muskarininių receptorių vaidmenį DETA sukeltoje proliferacijoje, buvo naudojama 10-8 M arba 10-5 M DETA, esant pFHHSiD (10-7 M, selektyvus M3 receptorių antagonistas). HUVEC gydymas. pFHHSiD visiškai blokavo DETA proliferacines savybes esant visoms koncentracijoms (1 lentelė).
Tokiomis sąlygomis taip pat tyrėme, ar DEET padidintų HUVEC ląstelių kapiliarų ilgį. Panašiai pFHHSiD reikšmingai užkirto kelią DEET sukeltam kapiliarų ilgiui (1a, b pav., pilkos juostos). Be to, panašūs eksperimentai buvo atlikti su M3 siRNA. Nors kontrolinė siRNA nebuvo veiksminga skatinant kapiliarų formavimąsi, M3 muskarininio receptoriaus nutildymas panaikino DEET gebėjimą padidinti kapiliarų ilgį (1a, b pav., juodos juostos).
Be to, pFHHSiD visiškai blokavo tiek 10-8 M, tiek 10-5 M DEET sukeltą vaskuliarizaciją in vitro, tiek neovaskuliarizaciją in vivo (1c, d pav., apskritimai). Šie rezultatai rodo, kad DEET skatina angiogenezę per kelią, jautrų selektyviems M3 receptorių antagonistams arba M3 siRNR.
AChE yra DEET molekulinis taikinys. Tokie vaistai kaip donepezilas, kurie veikia kaip AChE inhibitoriai, gali stimuliuoti endotelio angiogenezę in vitro ir pelių užpakalinių galūnių išemijos modeliuose14. Mes išbandėme dviejų DEET koncentracijų poveikį AChE fermento aktyvumui HUVEC ląstelėse. Maža (10-8 M) ir didelė (10-5 M) DEET koncentracijos sumažino endotelio AChE aktyvumą, palyginti su kontrolinėmis sąlygomis (2 pav.).
Abi DEET koncentracijos (10-8 M ir 10-5 M) sumažino acetilcholinesterazės aktyvumą HUVEC ląstelėse. BW284c51 (10-5 M) buvo naudojamas kaip acetilcholinesterazės inhibitorių kontrolė. Rezultatai išreikšti kaip AChE aktyvumo procentinė dalis HUVEC ląstelėse, paveiktose dviem DEET koncentracijomis, palyginti su ląstelėmis, paveiktomis preparato nešikliu. Vertės išreikštos kaip šešių nepriklausomų eksperimentų vidurkis ± SEM. *p < 0,05, palyginti su kontroline grupe (Kruskal-Wallis ir Dunn daugkartinių palyginimų testas).
Azoto oksidas (NO) dalyvauja angiogenezės procese33, todėl buvo tirta NO gamyba DEET stimuliuojamose HUVEC. DEET paveiktose endotelio NO gamyba padidėjo, palyginti su kontrolinėmis ląstelėmis, tačiau reikšminga reikšmė pasireiškė tik esant 10-8 M dozei (3c pav.). Siekiant nustatyti molekulinius pokyčius, kontroliuojančius DEET sukeltą NO gamybą, eNOS raiška ir aktyvacija buvo analizuojami Western blotavimo metodu. Nors DEET gydymas nepakeitė eNOS raiškos, jis reikšmingai padidino eNOS fosforilinimą jo aktyvavimo vietoje (Ser-1177), tuo pačiu sumažindamas jo slopinimo vietą (Thr-495), palyginti su neapdorotomis ląstelėmis eNOS fosforilinime (3d pav.). Be to, fosforilinto eNOS santykis aktyvavimo vietoje ir slopinimo vietoje buvo apskaičiuotas normalizavus fosforilinto eNOS kiekį ir bendrą fermento kiekį. Šis santykis reikšmingai padidėjo HUVEC, paveiktose kiekviena DEET koncentracija, palyginti su neapdorotomis ląstelėmis (3d pav.).
Galiausiai, VEGF, vieno iš pagrindinių proangiogeninių faktorių, raiška buvo analizuojama Western blotavimo metodu. DEET reikšmingai padidino VEGF raišką, o pFHHSiD visiškai blokavo šią raišką.
Kadangi DEET poveikis jautrus tiek farmakologinei M3 receptorių blokadai, tiek jų reguliacijos sumažėjimui, išbandėme hipotezę, kad DEET gali sustiprinti kalcio signalizaciją. Keista, tačiau DEET nepadidino citoplazminio kalcio kiekio HUVEC (duomenys nepateikti) ir HEK/M3 (4a, b pav.) ląstelėse, esant abiem naudotoms koncentracijoms.
Įrašo laikas: 2024 m. gruodžio 30 d.