Pesticidai atlieka itin svarbų vaidmenį sprendžiant pasaulinį maisto trūkumo problemą ir kovojant su vektorių platinamomis žmonių ligomis. Tačiau didėjanti atsparumo pesticidams problema reikalauja skubiai atrasti naujus junginius, kurie būtų nukreipti į nepakankamai naudojamus taikinius. Vabzdžių pereinamojo receptoriaus potencialo (TRPV) kanalai – Nanzhong (Nan) ir neaktyvūs (Iav) – gali sudaryti heterologinius kanalus (Nan-Iav) ir lokalizuotis mechanosensoriniuose organuose, kurie tarpininkauja geotropizmui, klausai ir propriocepcijai vabzdžiuose. Kai kurie pesticidai, pavyzdžiui, afidopirolidonas (AP), nukreipia Nan-Iav per nežinomus mechanizmus. AP veiksmingas prieš dusinančius ir čiulpiančius vabzdžius (hemipteranus), neleisdamas jiems maitintis sutrikdydamas filamentų funkciją. AP gali jungtis tik prie Nan, bet tik Nan-Iav gali sąveikauti su agonistais, įskaitant endogeninį nikotinamidą (NAM), taip parodydamas kanalų aktyvumą. Nepaisant Nan-Iav potencialo kaip insekticidų taikinio, mažai žinoma apie jo kanalų surinkimą, reguliavimo prisijungimo vietas ir Ca2+ priklausomą reguliavimą, o tai trukdo tolesniam insekticidų kūrimui. Šiame tyrime krioelektroninė mikroskopija buvo panaudota Nan-Iav struktūrai Hemiptera vabzdžiuose kalmodulino ligando neturinčioje būsenoje, taip pat su AP ir NAM ankirino pasikartojančios citoplazminės srities (ARD) riboje nustatyti. Keista, bet nustatėme, kad pats Nan baltymas gali sudaryti pentamerą, kurį stabilizuoja AP sukeliamos ARD sąveikos. Šis tyrimas atskleidžia molekulinę sąveiką tarp insekticidų ir agonistų bei Nan-Iav, pabrėžia ARD svarbą kanalų funkcijoje ir surinkime bei tyrinėja Ca2+ reguliavimo mechanizmą.
Vis labiau aštrėjant pasaulinei klimato kaitai, blogėjantis pasaulinis aprūpinimas maistu yra vienas iš pagrindinių XXI amžiaus iššūkių, turintis šalutinių pasekmių visuomenei.1,2Pasaulio sveikatos organizacijos ataskaitoje „Maisto saugumo ir mitybos padėtis pasaulyje 2023 m.“ (SOFI) apskaičiuota, kad maždaug 2,33 milijardo žmonių visame pasaulyje kenčia nuo vidutinio ar sunkaus maisto nepritekliaus – ilgalaikės problemos.3,4Deja, apskaičiuota, kad kasmet dėl kenkėjų ir patogenų prarandama 20–30 % ar daugiau pasėlių derliaus, o tikimasi, kad visuotinis atšilimas padidins kenkėjų atsparumą ir pasėlių pažeidžiamumą.4, 5, 6, 7, 8Pesticidų kūrimas yra labai svarbus ne tik siekiant apsaugoti pasėlius nuo kenkėjų ir sumažinti vektorių platinamų patogenų plitimą, bet ir kovojant su vektorių platinamomis žmonių ligomis, tokiomis kaip dengo karštligė, maliarija ir Čagaso liga, kurios tampa vis atsparesnės pesticidams.5, 9, 10, 11
Tarp pagrindinių neurotoksinių insekticidų taikinių heterotetramerinis TRPV kanalas Nanchung (Nan) -Inactive (Iav) yra insekticidų taikinių klasė, atrasta tik per pastarąjį dešimtmetį, įskaitant komerciškai prieinamus insekticidus, tokius kaip imidaklopridas ir piraklostrobinas.12, 13, 14Pusiau sintetinis insekticidas apidopirolifenas (AP) yra neseniai sukurtas ir komercializuotas produktas, kurio pagrindinis komponentas yra aktyvus insekticidas Inscalis®, kuris jungiasi su AP subnanomoliniu aktyvumo lygiu.15ŠP pasižymi mažu ūminiu toksiškumu apdulkintojams, naudingiems vabzdžiams ir kitiems netiksliniams organizmams, o naudojamas pagal etiketėje pateiktas instrukcijas gali sumažinti atsparumo kitiems insekticidams spaudimą.16, 17, 18Nan ir Iav yra plačiai paplitę tarp vabzdžių rūšių, yra ekspresuojami tik antenų ir galūnių chordalinio tempimo receptorių neuronuose ir yra labai svarbūs klausai, gravitacijos suvokimui ir propriocepcijai.13, 16, 19, 20, 21, 22AP, imidaklopridas ir piraklostrobinas stimuliuoja Nan-Iav kompleksą unikaliu mechanizmu, galiausiai slopindami proprioceptinį signalo perdavimą.13, 16, 23Ausis siurbiantiems vabzdžiams (hemipteranams), tokiems kaip amarai ir baltasparniai, propriocepcijos praradimas sutrikdo jų maitinimosi gebėjimą, o tai galiausiai lemia mirtį.13,24Įdomu tai, kad AP pasižymi dideliu afinitetu Nan-Iav kompleksui ir mažu afinitetu vienam Nan. AP prisijungimas prie Nan-Iav indukuoja elektros srovę, tačiau prisijungimas vien tik prie Nan nestimuliuoja kanalo aktyvumo. Pats Iav visiškai nesijungia su AP.16Tai rodo, kad Nan ir Iav gali jungtis ir sudaryti skirtingus Nan-Iav kanalų kompleksus (pvz., su skirtingais stechiometriniais santykiais arba skirtingais išsidėstymais tame pačiame stechiometriniame santykyje) arba kad AP gali jungtis prie kelių vietų. Be to, natūralus agonistas nikotinamidas (NAM) jungiasi prie Drosophila Nan-Iav mikromoliniu afinitetu, sukeldamas panašų poveikį kaip ir amarų (AP) in vitro.16,25ir slopina amarų dauginimąsi bei maitinimąsi, galiausiai sukeldamas jų mirtį25,26Šie duomenys kelia daug klausimų. Pavyzdžiui, lieka neaišku, kaip susidaro Nan-Iav heterodimeras, kurios jungimosi vietos naudojamos mažoms molekulėms moduliuoti ir kaip šios mažos molekulės reguliuoja kanalų funkciją slopindamos propriocepciją. Be to, lieka neaiškios priežastys, kodėl pats Nan yra neaktyvus ir turi mažą afinitetą AP, o Nan-Iav heterodimeras yra aktyvus ir jungiasi su AP su didesniu afinitetu. Galiausiai, mažai žinoma apie Ca2+ priklausomą Nan-Iav funkcijos reguliavimą ir kaip jis yra integruotas į neuronų signalizacijos procesus.13,21
Šiame tyrime, derindami krioelektroninės mikroskopijos, elektrofiziologijos ir radioligandų surišimo metodus, išaiškinome Nan-Iav susidarymą ir jo prisijungimo prie mažų molekulių reguliatorių mechanizmą. Be to, aptikome konstituciškai su Iav susijungusį kalmoduliną (CaM) ir AP stabilizuotus Nan pentamerus. Šie rezultatai suteikia svarbių įžvalgų apie kalcio jonų reguliavimą kanaluose, kanalų susidarymą ir veiksnius, lemiančius ligandų surišimo afinitetą. Dar svarbiau, patvirtinome, kad ARD atlieka pagrindinį vaidmenį šiuose procesuose. Mūsų atliktas pilnų vabzdžių kanalų, sujungtų su atitinkamais žemės ūkio pesticidais, tyrimas...27, 28, 29atveria pesticidų pramonės plėtros perspektyvas, gerindamas pesticidų veiksmingumą ir specifiškumą bei sudarydamas sąlygas taikyti TRPV nukreiptus junginius kitoms rūšims, siekiant spręsti pasaulinio aprūpinimo maistu problemas ir mažinti vektorių platinamų ligų plitimą.
Taip pat nustatėme, kad Nan-Iav reguliuoja Ca2+, o reguliavimo mechanizmą tarpininkauja konstituciškai surištas CaM. Svarbu tai, kad šis nuo Ca2+ priklausomas Nav reguliavimas CaM reikšmingai skiriasi nuo kitų jonų kanalų (pvz., įtampos reguliuojamų Na+ kanalų ir TRPV5/6 kanalų) reguliavimo mechanizmų.52, 53, 54, 55, 56, 57Nav1.2 kanale CaM C-galinis domenas spirališkai jungiasi su C-galiniu domenu (CTD), o Ca2+ indukuoja jo N-galinio domeno prisijungimą prie distalinės CTD dalies.56TRPV5/6 kanale CaM C-galinis domenas jungiasi prie CTH, o Ca2+ sukelia jo N-galinio domeno išplitimą į porą, taip blokuodamas katijonų pralaidumą.53,54Siūlome Nan-Iav-CaM Ca2+ reguliuojamos funkcijos modelį (4h pav.). Šiame modelyje CaM N-galinis domenas konstituciškai jungiasi su Iav C-galiniu domenu (CTH). Ramybės būsenoje (maža [Ca2+] koncentracija) CaM C-galinis domenas sąveikauja su Nan, stabilizuodamas ARD konformaciją ir taip skatindamas kanalo atsidarymą. Agonisto/insekticido prisijungimas prie kanalo sukelia porų atsidarymą, dėl ko patenka Ca2+. Tada Ca2+ prisijungia prie CaM, sukeldamas C-galinio domeno disociaciją nuo Nan ARD. Kadangi CaM prisijungimo blokavimas iš esmės panaikina slopinamąjį Ca2+ poveikį, ši disociacija moduliuoja ARD judrumą, taip sukeldama nuo Ca2+ priklausomą slopinimą arba desensibilizaciją. Greitas kanalų srovių atsistatymas po kalcio jonų eliucijos (4g pav.) rodo, kad šis mechanizmas palengvina greitą atsaką į Ca2+ tarpininkaujamus neuroninius signalus. Be to, pranešama, kad Iav C-galinis regionas, kuris vis dar nėra iki galo ištirtas, atlieka ir kitus vaidmenis kanalų nukreipime ir srovės reguliavime.21
Galiausiai, mūsų tyrime pristatoma žemės ūkyje svarbos insekticido-insekticido TRP kanalo komplekso didelės skiriamosios gebos struktūra – atradimas, apie kurį anksčiau nežinojome. Pažymėtina, kad apibūdinome vabzdžių kanalo struktūrą ir funkciją žmogaus ląstelėse (HEK293S GnTi–), o ne vabzdžių ląstelėse. Atsižvelgiant į didėjantį atsparumą insekticidams ir nuolatinį spaudimą maisto saugumui bei patogenams, mūsų darbas suteikia svarbios informacijos, kuri palengvins naujų insekticidų kūrimą žmonių sveikatos ir pasaulinio maisto saugumo labui. Tyrimai parodė, kad tokie insekticidai kaip AP yra veiksmingi prieš kai kuriuos kenkėjus, kai naudojami pagal etiketėje pateiktas instrukcijas, ir pasižymi mažu ūminiu toksiškumu naudingiems apdulkintojams, o tai įrodo jų saugumą aplinkai.13,16Be to, kai kurių ŠP darinių tyrimai su uodais parodė, kad jie galiausiai praranda gebėjimą skraidyti. Supratimas, kaip šie moduliuojantys junginiai jungiasi prie Nan-Iav, palengvins esamų junginių modifikavimą arba naujų junginių kūrimą, kad jie būtų veiksmingesni ir...tiksluskenkėjų kontrolė. Mūsų tyrimas rodo, kad Nan-Iav ARD sąsaja yra labai svarbi ne tik reguliuojant endogeninių junginių, pesticidų ir Ca2+-CaM aktyvumą, bet ir kanalų surinkimui. Manome, kad heterodimerų surinkimo sutrikdymas mažomis molekulėmis gali būti unikalus ir perspektyvus jonų kanalų inhibitorių kūrimo būdas.
Iš aštuonių ortologinių genų buvo atrinkti rudojo vabalo (Halyomorpha halys) pilno ilgio genai Nanchung ir Inactive, pasižymintys puikiu stabilumu detergentuose. Susintetinti genai buvo optimizuoti kodonais žmogaus ekspresijai ir klonuoti į pBacMam pCMV-DEST vektorių (Life Technologies) naudojant XhoI ir EcoRI restrikcijos vietas. Tai užtikrino, kad klonai būtų rėmelyje su C-galo GFP-FLAG-10xHis ir mCherry-FLAG-10xHis žymėmis, kurias skaldo HRC-3C proteazė (PPX), leisdama nepriklausomusišraiškaNanchung ir Inactive klonavimui į pBacMam vektorių buvo naudojami šie pradmenys:
Atskirų dalelių mikroskopiniai vaizdai buvo gauti naudojant „Titan Krios G2“ transmisinį elektroninį mikroskopą (FEI) su K3 kamera ir „Gatan BioQuantum“ energijos filtru. Mikroskopas veikė esant 300 keV įtampai, 20 eV energijos nustatymui, 1,08 Å/pikselio mėginio pikselio dydžiui (nominalus padidinimas 81 000 kartų) ir defokusavimo gradientui nuo -0,8 iki -2,2 μm. Vaizdo įrašymas buvo atliekamas 40 kadrų per sekundę greičiu, naudojant „Latitude S“ mikroskopą („Gatan“), kurio nominali dozės galia buvo 25 e–px−1 s−1, ekspozicijos trukmė – 2,4 s, o bendra dozė – maždaug 60 e–Å−2.
Pluošto sukelto judesio korekcija ir dozės svertinis įvertinimas buvo atliktas naudojant „MotionCor2“ programoje „RELION 4.061“. Kontrasto perdavimo funkcijos (CTF) parametrų įvertinimas buvo atliktas programoje „cryoSPARC“, naudojant lopinėlių pagrindu veikiantį CTF įvertinimo metodą62. Fotomikrografijos, kurių CTF pritaikymo skiriamoji geba ≥4 Å, buvo pašalintos iš tolesnės analizės. Paprastai taškų pasirinkimui „cryoSPARC“ programoje buvo naudojamas 500–1000 fotomikrografijų pogrupis, po kurio, filtravus, buvo atlikti keli 2D klasifikavimo etapai, siekiant gauti aiškų etaloninį vaizdą dalelių pasirinkimui pagal šabloną. Tada dalelės buvo išskirtos naudojant 64 pikselių ribojančias dėžutes ir 4 kartų suskaidymą. Buvo atlikti keli 2D klasifikavimo etapai, siekiant pašalinti nepageidaujamas dalelių kategorijas. Pradinis 3D modelis buvo rekonstruotas naudojant ab initio rekonstrukciją ir patikslintas naudojant netolygų patikslinimą „cryoSPARC“ programoje. 3D klasifikavimas buvo atliktas „cryoSPARC“ arba „RELION“ programose, remiantis ARD heterogeniškumu. Reikšmingo membranos domenų heterogeniškumo nepastebėta. Dalelės buvo patikslintos naudojant C1 ir C2 metodus; Dalelės su didesne C2 skiriamąja geba buvo laikomos simetriškomis C2 atžvilgiu ir importuotos į RELION Bajeso patikslinimui. Tada dalelės buvo perkeltos atgal į cryoSPARC galutiniam netolygiam ir lokaliam patikslinimui. Galutinė skiriamoji geba ir dalelių skaičius pateikti 1 lentelėje.
Apdorojant Nan+AP pentamerus, tyrėme įvairius membranų domenų (ypač porų srities) skiriamosios gebos gerinimo metodus, tokius kaip signalo atimtis ir TMD maskavimas. Tačiau šie bandymai buvo nesėkmingi dėl potencialiai didelio porų srities netvarkingumo ir bendro TMD heterogeniškumo. Galutinė skiriamoji geba buvo apskaičiuota naudojant kaukę, automatiškai sugeneruotą netolygaus apdorojimo metodu cryoSPARC programoje, pirmiausia orientuojantis į ARD sritį. Taip buvo pasiekta žymiai didesnė skiriamoji geba nei membranų domenų (ypač VSLD srities).
Pradiniai Nanchung ir neaktyvių vabzdžių apo formų de novo modeliai pirmiausia buvo sukurti naudojant Coot63, o Nan ir Iav vabzdžių modeliai – naudojant AlphaFold264, siekiant nustatyti mažo patikimumo regionus. Kalmodulino modeliavimas buvo pagrįstas Ca2+ surišančio ir Ca2+ neturinčio modelių standaus kūno atitikmenimis atitinkamai PDB prieigose 4JPZ56 ir 1CFD65. Modeliai buvo patikslinti naudojant sferinį patikslinimą, siekiant užtikrinti teisingą stereochemiją ir gerą geometriją. Fosfatidilcholinas, fosfatidiletanolaminas ir fosfatidilserinas buvo sumodeliuoti kaip tiksliai apibrėžti lipidų tankiai, o NAM ir AP ligandai buvo patalpinti atitinkamuose tankiuose sandariose jungtyse. Apribojimų failai buvo sugeneruoti iš izoformų SMILES eilutės naudojant eLBOW PHENIX66 programoje. Galiausiai modeliai buvo patikslinti realioje erdvėje PHENIX programoje, naudojant vietinę tinklelio paiešką ir globalų minimalizavimą su antrinės struktūros apribojimais. Modelio patikslinimui ir struktūrinei analizei buvo naudojamas „MolProbity“ serveris, o iliustracijos buvo atliktos naudojant „PyMOL“ ir „UCSF Chimera X“.67,68,69 Diafragmos analizė buvo atlikta naudojant HOLE serverį,70 o sekos išsaugojimo žemėlapių sudarymas – naudojant „Consurf“ serverį.71
Statistinė analizė atlikta naudojant „Igor Pro 6.2“, „Excel Office 365“ ir „GraphPad Prism 7.0“. Visi kiekybiniai duomenys pateikiami kaip vidurkis ± standartinė paklaida (SEM). Dviejų grupių palyginimui naudotas Stjudento t-testas (dvipusis, neporinis). Kelių grupių palyginimui naudota vienfaktorinė dispersinė analizė (ANOVA), po kurios sekė Dunnett'o post hoc testas. *P< 0,05, **P< 0,01 ir ***P< 0,001 buvo laikomi statistiškai reikšmingais, priklausomai nuo duomenų pasiskirstymo. Kd, Ki vertės ir jų asimetriniai 95 % patikimumo intervalai buvo apskaičiuoti naudojant „GraphPad Prism 10“.
Daugiau informacijos apie tyrimo metodiką rasite šiame straipsnyje pateiktoje „Gamtos portfelio ataskaitos santraukoje“.
Pradinis modelis buvo sukurtas naudojant kalmodulino modelius iš PDB 4JPZ ir 1CFD duomenų bazių. Koordinatės buvo deponuotos Baltymų duomenų banke (PDB) šiais numeriais: 9NVN (Nan-Iav-CaM be ligando), 9NVO (Nan-Iav-CaM, prijungtas prie nikotinamido), 9NVP (Nan-Iav-CaM, prijungtas prie nikotinamido ir EDTA), 9NVQ (Nan-Iav-CaM, prijungtas prie afenidolpirolino ir kalcio), 9NVR (Nan-Iav-CaM, prijungtas prie afenidolpirolino ir EDTA) ir 9NVS (Nan pentameras, prijungtas prie afenidolpirolino). Atitinkami krioelektroninės mikroskopijos vaizdai yra patalpinti elektroninės mikroskopijos duomenų bazėje (EMDB) šiais registracijos numeriais: EMD-49844 (Nan-Iav-CaM be ligando), EMD-49845 (Nan-Iav-CaM kompleksas su nikotinamidu), EMD-49846 (Nan-Iav-CaM kompleksas su nikotinamidu ir EDTA), EMD-49847 (Nan-Iav-CaM kompleksas su afidopirolinu ir kalciu), EMD-49848 (Nan-Iav-CaM kompleksas su afidopirolinu ir EDTA) ir EMD-49849 (Nan pentamero kompleksas su afidopirolinu). Šiame straipsnyje pateikti neapdoroti funkcinės analizės duomenys.
Įrašo laikas: 2026 m. sausio 28 d.